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镍柱亲和色谱文献资料
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人β-NGF在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定
目的 利用大肠杆菌表达系统表达经密码子突变的重组人神经生长因子(rhβ-NGF),并对表达产物进行分离纯化和生物学活性鉴定.方法 利用化学合成法合成经密码子突变后的人神经生长因子β亚基成熟肽段基因及前导肽基因;构建原核表达载体pET28a(+)+[rhβ-NGF],转化大肠杆菌株BL21(λDE3),获得基因工程菌;利用IPTG诱导rhβ-NGF在基因工程菌中表达并收集菌体;分离纯化包涵体蛋白,经体外复性及肠激酶切割去除前导肽后进一步通过镍柱亲和色谱获得rhβ-NGF;通过PC12细胞存活法检测rhβ-NGF的活性.结果 构建的基因工程菌能大量表达包涵体蛋白,体外稀释复性后获得的重组蛋白经SDS-PAGE电泳检测其纯度大于95％,Western blot检测其为目标蛋白;重组蛋白经肠激酶切割及进一步分离纯化后得到的目的蛋白经SDS-PAGE电泳检测为单一条带,纯度大于99％;经Western blot鉴定其为rhβ-NGF;生物学活性检测结果显示其比活性约为500000 u·mg-1.结论 通过优化设计密码子,建立重组人神经生长因子大肠杆菌表达系统,并实现其在大肠杆菌中的高水平表达.
