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六价铬对肝细胞内活性氧和腺苷酸转运体1转录水平的影响
目的 探讨重金属六价铬[Cr(Ⅵ)]的体外肝毒性.方法 L-02肝细胞经Cr(Ⅵ)0,2,4,8,16和32 μmol· L-1分别染毒12,24或36 h后,采用逆转录-荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和荧光光度法分别对腺苷酸转运体1( ANT1) mRNA表达水平和活性氧簇(ROS)水平进行检测.结果 Cr(Ⅵ)32 μmol · L-1处理细胞12和24 h后,ROS水平明显升高,而处理36 h后,ROS水平明显下降.Cr(Ⅵ)2～32 μmol·L-1处理细胞12和24 h后,细胞内ANT1 mRNA呈明显低表达水平,而处理36 h后,细胞内ANT1 mRNA表达水平明显增高,达正常对照组的2倍左右.结论 Cr(Ⅵ)在早期(12,24 h)可使L-02肝细胞内ROS水平升高,发生氧化应激,在后期(36 h)可诱导ANT1 mRNA表达水平升高,发生能量代谢应激,可能是Cr(Ⅵ)诱导细胞线粒体损伤的分子毒性机制之一.
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大鼠ANT1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备
目的:表达和纯化大鼠腺苷酸转运体(ANT1)蛋白并制备其多克隆抗体.方法:通过PCR扩增大鼠脑组织中ANT1的编码区序列,构建ANT基因重组载pET28a-ANT1,转化至E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni~(2+)-NTA离子交换树脂层析纯化;纯化的ANT1蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并亲和纯化,并通过Western Blot法鉴定其特异性.结果:成功构建重组质粒pET28a-ANT1,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了Mr约为32×10~3的目的蛋白;亲和层析纯化后免疫的新西兰大白兔获得其多克隆抗体;曝光后胶片上均可见Mr 32×10~3的阳性条带,与纯化的大鼠ANT1重组蛋白处于同一水平,表明纯化的抗ANT多克隆抗体具有高度的特异性.结论:利用基因重组技术,在大肠杆菌中成功表达了大鼠ANT1融合蛋白并制备了其多克隆抗体,为研究腺苷酸转运体蛋白在癫痫发病过程中的作用机制奠定了基础.
