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基于随机聚合酶链反应的病原菌基因芯片检测技术
目的 建立一种基于随机聚合酶链反应的病原细菌基因芯片筛查检测技术.方法 用生物学软件分析7种病原菌特异性基因序列的保守性区域,利用Oligo 6.0软件设计针对靶细菌的一系列探针,制备检测用基因芯片.细菌基因组DNA在随机引物扩增中掺入氨基丙烯-dUTP,产物偶联荧光染料后与芯片上探针杂交,通过芯片扫描仪和图像分析软件对结果进行判断.选取19种病原菌基因组DNA进行芯片特异性验证和灵敏度评价,使用问号钩端螺旋体对应靶探针进行基因芯片检测方法重复性验证,并制备问号钩端螺旋体模拟水污染样本进行芯片检测.结果 在均一的杂交条件下4种靶细菌均能得到相应特异性杂交图谱,其他非目的 细菌均为阴性结果,3种靶细菌基因组DNA低检测浓度为14.43～363.4 pg/μl,芯片重复性变异系数CV值＜15%,低可检测含问号钩端螺旋体7×105条/ml模拟水污染样本.结论 初步建立的随机聚合酶链反应结合芯片技术的检测方法可用于多种病原菌筛查检测,为细菌高通量筛查与鉴定技术提供了新的思路和实验依据.
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随机聚合酶链反应检测未知病毒方法学的建立
目的 探索并建立一种用于快速检测未知病毒的分子生物学方法.方法 分别以乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)为假定的未知DNA、RNA病毒,验证随机聚合酶链反应(PCR)检测未知病毒的可行性.分离HBV、HCV的阳性血清,去除宿主DNA后,提取病毒核酸.锚定随机引物经Klenow酶处理(模板为DNA)或反转录酶作用(模板为RNA)退火至模板,随后用锚定特异引物对模板进行非特异性扩增.扩增产物经纯化后克隆、测序,后与BLAST进行比对.结果 经BLAST比对证实,插入序列中有HBV和HCV的基因组片段,在病毒为1×106拷贝/ml时,被检测克隆的阳性率约为15%.目前我们利用本法能达到的检测低限大致为1×104拷贝/ml.结论 成功建立了一种基于随机PCR的未知病毒检测方法,其优点在于不依赖病毒的细胞培养及其核酸序列信息.这种方法的建立为快速检测不明原因疾病和新发传染病病原体提供了新的思路.
