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Endo-H在毕赤酵母中的表达、纯化及其在N-糖基化分析中的应用
目的:通过巴斯德毕赤酵母( Pichia pastoris)表达制备内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶-H( endo-beta-N-acetyl-glucosaminidase H ,Endo-H),并用于蛋白质的N-糖基化分析。方法根据GenBank中公布的褶皱链霉菌( Strepto-myces plicatus) Endo-H的cDNA序列,设计并合成Endo-H全基因,将其克隆至P.pastoris表达载体pPIC9中,重组质粒转化P.pastoris JC308宿主菌,工程菌经甲醇诱导,分泌表达Endo-H,目的蛋白经疏水层析、凝胶过滤两步纯化后,纯度可>95%。成品用于基于DNA测序的荧光辅助糖电泳( DNA sequencer assisted fluorophore-assisted carbohy-drate electrophoresis,DSA-FACE)分析核糖核酸酶B(ribonuclease B,RNaseB)的糖基结构,比较了Endo-H与商品化N-糖酰胺酶F(peptide-N-asparigine amidase F,PNGase F)的糖基切割功能。结果利用P.pastoris表达制备Endo-H,可切割天然或变性状态下的β-1,4-糖苷键连接的甘露糖型结构糖链,不能切割复杂型糖链糖蛋白;经DSA-FACE分析,结果显示Endo-H酶切RNaseB后其糖链为Man5 GlcNAc-Man9 GlcNAc,PNGaseF酶切RNaseB的糖链为Man5 GlcNAc2-Man9 GlcNAc2,两者相差一个GlcNAc。结论通过P.pastoris制备的Endo-H具有天然生物活性,可用于蛋白质的N-糖基化结构分析。
关键词: 内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H 毕赤酵母 N-糖基化