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应用抑制性消减杂交技术筛选XTP3的反式激活基因
目的应用抑制性消减杂交技术构建乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP3的差异表达的cDNA消减文库,克隆XTP3反式激活相关基因.方法以XTP3表达质粒pcDNA3.1(-)-XTP3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果文库扩增后得到30个白色克隆,经菌落PCR分析,得到23个200～1 000bp插入片段.对所得片段测序,并进行同源性分析,共得到20种已知基因序列和2种未知功能基因序列,可能是XTP3反式激活靶基因. 结论成功构建了乙型肝炎病毒XTP3反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定了基础.
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XTP3基因融合蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备
目的 构建稳定表达乙肝病毒XTP3蛋白的原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导融合蛋白的表达,制备兔抗XTP3蛋白多克隆抗体并检测该抗体在乙肝肝癌、正常肝组织中的作用效果.方法 PCR获得XTP3基因片段,插入至pET-32a(+)中构建原核表达载体pET-32a(+)-XTP3,测序正确后转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达.SDS-PAGE、Western blotting分析鉴定融合蛋白的表达.利用Ni亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性.免疫新西兰兔,制备多克隆抗体并进行ELISA、Western blotting及免疫组化验证.结果 成功构建pET-32a(+)-XTP3表达载体并在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的XTP3融合蛋白,目的蛋白分子量为52kD,SDS-PAGE分析表明为包涵体表达.经亲和树脂纯化后免疫新西兰兔,成功获得融合蛋白及兔抗XTP3多克隆抗体.ELISA检测证明多克隆抗体效价>1:128 000.免疫组化证实本实验中XTP3多克隆抗体在肝癌组织中的表达呈明显的细胞膜阳性,特异性良好.结论成功表达、纯化了XTP3基因融合蛋白,获得高特异性、高效价兔抗XTP3多克隆抗体,为进一步研究XTP3蛋白的生物学特性奠定了基础.
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新基因XTP3反式激活基因TPA的克隆化研究
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP3的差异表达的cDNA消减文库,克隆XTP3反式激活相关基因.方法:依据我室构建的HBVX蛋白反式激活基因XTP3差异表达的cDNA消减文库,利用生物信息学技术获得新基因XTP3TPA的编码序列,对其可能的氨基酸序列进行分析比较,并对其进行克隆化研究.结果:发现了HBV XTP3反式激活作用的新的靶基因,命名为XTP3TPA.结论:这一发现为阐明HBVXTP3蛋白的反式激活作用及其机制开辟了新的研究方向.
