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杞精明目汤含药血清对结膜松弛症MAPK信号通路的影响
目的 探讨杞精明目汤含药血清对结膜松弛症(CCh)成纤维细胞表达丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的影响及其作用机制.方法 体外培养结膜松弛症结膜成纤维细胞并鉴定,分为CCh对照组、CCh+20%含药血清组(含药血清组)、CCh+20%无药血清组(无药血清组),予20%的含药或无药血清干预48 h.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)及其磷酸化水平的光密度值,Western Blot 检测p38 MAPK、JNK、ERK 蛋白及其磷酸化水平,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测p38 MAPK、JNK、ERK的mRNA表达,并行统计学分析.结果 ELISA结果显示:含药血清组较CCh对照组p38 MAPK、p-p38 MAPK光密度值明显降低(P＜0.05),而无药血清组与CCh对照组差异无统计学意义(P>0.05).含药血清组较CCh对照组JNK光密度值降低(P＜0.05),而无药血清组与CCh对照组差异无统计学意义(P>0.05);含药血清组、无药血清组较CCh对照组p-JNK光密度值下降(P＜0.05).含药血清组较CCh对照组ERK、p-ERK光密度值下降,差异有统计学意义(P＜0.05);而无药血清组与CCh对照组差异均无统计学意义(P>0.05). Western Blot结果显示:含药血清组、无药血清组较CCh对照组p-p38 MAPK蛋白表达量明显下降(P＜0.05),且20%含药血清的p38 MAPK蛋白磷酸化水平下调更为明显.含药血清组、无药血清组与CCh对照组JNK、p-JNK蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05).含药血清组、无药血清组与CCh对照组ERK蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05);含药血清组、无药血清组较CCh对照组p-ERK蛋白表达量均明显降低(P＜0.05),其中含药血清组的ERK蛋白磷酸化水平下调更为明显. RT-PCR结果显示:无药血清组和含药血清组较CCh对照组p38 MAPK、 JNK、ERK的mRNA表达水平均显著下降,差异有统计学意义(P＜0.05),且20%含药血清组p38 MAPK、JNK、ERK mRNA 水平下调更为明显.结论 杞精明目汤含药血清可下调结膜松弛症成纤维细胞MAPK信号通路相关蛋白和基因的表达,其对p38 MAPK、ERK蛋白的磷酸化水平和基因表达的抑制,可能是该方疗效机制的关键.
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杞精明目汤药物血浆对结膜松弛症成纤维细胞TSG-6和PTX3表达的影响
目的 研究杞精明目汤药物血浆对结膜松弛症成纤维细胞肿瘤坏死因子α刺激基因6(TSG-6)和穿透素3(PTX3)表达的影响,探讨结膜松弛症的发病机制及杞精明目汤对其影响作用.方法 制备杞精明目汤药物血浆和无药血浆,分别用含20％、10％、5％药物血浆或无药血浆的细胞全培养基培养结膜松弛症成纤维细胞,4h、24 h后分别提取mRNA和蛋白质,采用实时荧光定量PCR (real time PCR)技术和Western blot法检测细胞TSG-6、PTX3以及基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-3的表达.结果 20％和10％的含药血浆均可有效上调结膜松弛症成纤维细胞TSG-6 mRNA和蛋白的表达,且作用接近(P＞0.05),而5％浓度的含药血浆对TSG-6 mRNA和蛋白的表达无明显上调作用.三种浓度的含药血浆对结膜松弛症成纤维细胞PTX3mRNA和蛋白的表达无明显作用.三种浓度的含药血浆均可明显抑制结膜松弛症成纤维细胞MMP-1 mRNA和蛋白的表达,其中20％和10％浓度对MMP-1mRNA抑制作用较强,效果接近(P＞0.05),其次为5％;20％浓度含药血浆对MMP-1蛋白表达的抑制作用明显,10％和5％浓度对MMP-1蛋白表达的抑制作用无明显差异(P＞0.05).三种浓度的含药血浆均可有效抑制MMP-3 mRNA和蛋白的表达,其中对MMP-3 mRNA及蛋白的抑制作用显著的均为20％浓度的含药血浆,其次为10％.结论 20％和10％浓度的杞精明目汤药物血浆能有效上调TSG-6的表达;20％、10％、5％三种浓度的含药血浆对PTX3的表达均无明显作用;三种浓度的杞精明目汤药物血浆均能有效抑制MMP-1、MMP-3的表达.
关键词： 结膜松弛症 杞精明目汤 肿瘤坏死因子α刺激基因6 穿透素3 -
结膜松弛症球结膜成纤维细胞培养的研究
目的:为了筛选适合结膜松弛症结膜成纤维细胞培养的方法,对不同培养基培育及杞精明目汤药物血清作用前后的结膜松弛症和正常球结膜成纤维细胞进行观察.方法:收集结膜松弛症松弛结膜组织16例、翼状胬肉组织11例和正常球结膜组织5例,观察成纤维细胞的生长状态,筛选适合结膜松弛症成纤维细胞生长的培养基.结果:采用DMEM/F12培养基可使结膜松弛症成纤维细胞少量从组织块内溢出,但不能传代.采用含100mL/L胎牛血清、1μL/mL成纤维细胞生长添加物(FGS)的DMEM-H培养基可使结膜松弛症成纤维细胞顺利生长,且能够传代.结论:适宜培养结膜松弛症成纤维细胞的培养基是含100mL/L胎牛血清、1μL/mL FGS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM-H培养基.
