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Minocycline降低耳蜗毛细胞内蛋白质硝基反应拮抗链霉素耳毒性的研究
目的 观察minocycline对链霉素诱导的耳毒性的拮抗作用.方法 选用新生4天的Wistar大鼠60只,分离耳蜗进行离体培养.随机分为4组,包括正常培养的对照组,100μmol/L的minocycline作用组,500 μ mol/L的硫酸链霉素作用组,100 μ mol/L的minocycline预处理6 h然后500 μ mol/L的硫酸链霉素作用组.采用F-actin标记毛细胞纤毛观察毛细胞存活情况.免疫组织化学染色法检测耳蜗基底膜3-硝基酪氨酸的表达.Western Bloting检测耳蜗组织中iNOS、3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)的表达.结果 500μmol/L的链霉素作用24 h后毛细胞出现缺失,从顶回至底回逐渐严重.支持细胞未见异常.免疫组化结果显示3-NT在毛细胞区域呈阳性表达.Minocycline预处理组能够提高链霉素作用后的毛细胞存活率,并且minocycline显著降低耳蜗组织由链霉素引起的iNOS和3-NT蛋白过表达.结论 minocycline对链霉素所致的耳蜗毛细胞损伤有拮抗作用,其机制可能部分通过抑制NO的过度生成,以减少耳蜗细胞内过氧亚硝基阴离子(ONOO-)产生的蛋白质硝基化反应.
关键词： minocycline 链霉素 耳毒性 耳蜗毛细胞 蛋白硝基化 -
硫氧还蛋白通过阻断过氧亚硝酸阴离子导致的蛋白硝基化减少缺血后心肌细胞凋亡
目的:本研究旨在阐明硫氧还蛋白(Trx)心肌保护作用的机制.方法:采用成年雄性小鼠心肌30 min缺血/3 h再灌注模型,再灌注前10 min随机给予磷酸缓冲液(PBS,对照)或重组人Trx (hTrx,2 mg/kg) 腹腔注射.在再灌注终末,摘取实验动物的心脏,分别检测心肌细胞凋亡和心肌组织中硝基酪氨酸的含量.结果:再灌注前给予Trx可以显著减少缺血/再灌注导致的心肌细胞凋亡(P＜0.01);与对照组相比,Trx组心肌组织中硝基酪氨酸的含量显著减少 (4.8±0.53 比 9.5±0.86 pmol/mg蛋白质,P＜0.01), 提示Trx可能通过阻断蛋白硝基化和随后的细胞凋亡而发挥心脏保护作用.为了寻找Trx可以阻断蛋白硝基化的直接证据,在培养的成年心肌细胞给予SIN-1 (过氧亚硝酸阴离子供体) 50 μmol处理、或SIN-1 和hTrx(500 nmol)共同处理后,观察Trx 在过氧亚硝酸阴离子诱导的细胞凋亡中的作用.结果表明SIN-1 处理导致心肌细胞凋亡显著增加 (P＜0.01),Trx可以显著减少SIN-1导致的心肌细胞凋亡(P＜0.01) .结论:硫氧还蛋白,一种新的抗凋亡和心肌保护分子,通过阻断过氧亚硝酸阴离子导致的蛋白硝基化和随后的细胞凋亡而发挥心脏保护作用.
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硝基化修饰导致硫氧还蛋白不可逆的丧失了对心脏的保护作用
目的:本研究旨在明确过氧亚硝酸阴离子是否可以导致硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX,一种新的抗氧化和抗凋亡蛋白质)硝基化修饰失活,从而促进缺血/再灌注心肌细胞凋亡.方法和结果:硫氧还蛋白中加入100 μmol/L SIN-1(过氧亚硝酸阴离子供体)离体孵育可导致TRX发生硝基化,提示心肌组织内TRX也对硝基修饰敏感.为进一步确定TRX硝化是否改变其心肌保护作用,采用缺血30 min,再灌注3 h(凋亡检测)或24h(心肌梗死范围)小鼠缺血/再灌注模型,分别于再灌前10 min给予磷酸盐缓冲液(PBS,对照组),TRX或硝化TRX.TRX治疗可以显著减少缺血/再灌注导致的心肌细胞凋亡和心肌梗死范围(P＜0.01);而在体外用SIN-1孵育TRX,则完全阻断了其心肌保护作用;此外,用SIN-1和血红蛋白(清除NO)或SIN-1和超氧化物岐化酶(SOD,清除过氧化物)同时孵育TRX,其心肌保护作用则完全保留.结论:上述结果表明,SIN-1通过产生过氧亚硝酸阴离子使TRX失活(丧失对心脏的保护作用),提示过氧亚硝酸阴离子可能通过使TRX硝基化失活而发挥促凋亡作用.
