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PMA诱导Hela细胞ROS升高机制研究
目的 活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)升高是癌症转移的主要原因之一,ROS已成为一种新的抗癌靶点,但其形成机制尚未完全阐明.本研究以佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导Hela细胞ROS升高为模型,探讨Hela细胞ROS升高的相关机制.方法 500 ng/mL的PMA诱导Hela细胞0.5 h,荧光酶标仪检测Hela细胞经过PMA诱导后的ROS产量,蛋白质印迹法检测Hela细胞经过PMA诱导后的HIF-1α 、Rac2和NOX2蛋白的表达量.结果 500 ng/mL PMA诱导Hela细胞0.5、1、2和4 h,与空白对照组比较,P值分别为<0.001、0.055、0.125和0.135,表明0.5 h为PMA诱导Hela细胞ROS升高的佳诱导条件.500 ng/mL PMA诱导Hela细胞0.5 h后,诱导组中HIF-1α 、Rac2和NOX2蛋白条带灰度平均值分别为15833.33±63.13、20448.33±78.65和21840.33±123.91,均高于空白组的9853.33±124.13、9782.00±93.62和10638.33±106.57,均P<0.001,表明PMA诱导了HIF-1α 、Rac2和NOX2蛋白的高表达.荧光酶标仪检测Hela细胞ROS结果显示,echinomycin组 、NSC23766组和DPI组与PMA组比较,P值分别为<0.001、0.003和<0.001,表明HIF-1α 、Rac2和NOX2抑制剂均抑制了Hela细胞中PMA诱导的ROS升高.蛋白质印迹法检测结果显示,空白组HIF-1α 、Rac2和NOX2灰度平均值分别为13571.00±287.68、10495.67±253.72和17403.33±162.87,PMA组分别为22946.33±67.10、30578.67±251.11和30582.00±88.39,NSC23766组分别为22629.67±445.26、3919.00±41.68和22618.67±161.51,echinomycin组分别为16691.33±9.504、15424.00±315.05和14899.00±71.55,DPI组分别为22970.00±714.88、30120.33±555.05和5787.00±12.29.echinomycin组与PMA组比较,均P<0.001,表明echinomycin抑制了PMA诱导的HIF-1α 、Rac2和NOX2蛋白的高表达;NSC23766组与PMA组比较,P值分别为0.354、<0.001和<0.001,表明NSC23766抑制了PMA诱导的Rac2和NOX2蛋白的高表达,但没有抑制HIF-1α 蛋白的高表达;DPI组与PMA组比较,P值分别为0.944、0.117和<0.001,表明DPI抑制了PMA诱导的NOX2蛋白的高表达,但没有抑制HIF-1α 和Rac2蛋白的高表达.结论 PMA能引起Hela细胞ROS升高,该现象依赖HIF-1α/Rac2/NOX2途径.这可能为阐明与ROS升高相关的癌症转移分子机制 、干预癌症转移的靶向治疗分子研究提供思路.
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中性粒细胞小GTP结合蛋白的表达与冠心病发生关系的研究
目的:探讨中性粒细胞活性氧的产生及小GTP结合蛋白Rac2和RhoGDI的差异性表达在冠心病(GHD)发生发展中的作用.方法:采用化学发光法检测活性氧,适时定量RT-PCR检测调控中性粒细胞活性氧产生的两种小GTP结合蛋白Rac2和RhoGDI mRNA表达量的变化.结果:冠心病组中性粒细胞产生活性氧显著增多,冠心病人血清中各种炎性因子有促进中性粒细胞产生活性氧的作用;Rac2mRNA在冠心病组表达量显著性高于正常对照组,而RhoGDI mRNA的表达量在两组中无显著区别,Rac2mRNA和RhoGDImRNA表达量的比值与中性粒细胞产生活性氧的峰值呈正相关.结论:中性粒细胞通过产生活性氧参与冠心病的发生发展,冠心病病人中性粒细胞Rac2和RhoGDI mRNA表达量比例失调是导致活性氧产生增多的重要因素.
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DADS对人白血病细胞和淋巴瘤细胞诱导凋亡作用比较研究
大蒜及其烯丙基硫化物的抗肿瘤作用正日益受到关注[1-2]。我们的前期研究显示,DADS对人白血病HL-60细胞具有双效作用,小剂量DADS(<1．25 mg·L-1)诱导人白血病细胞分化,而中等剂量DADS(>1.25 mg·L-1)可诱导人白血病细胞凋亡[3-4]。我们的前期研究表明, Rac2与DADS诱导人白血病细胞凋亡相关[5],且DADS通过活性氧介导的JNK信号通路诱导HL-60细胞的凋亡,且NADPH氧化酶的活化是DADS诱导HL-60细胞凋亡过程ROS的主要来源[6-7]。本研究在前期工作基础上,比较DADS对人早幼粒白血病系HL-60细胞、人慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞、人何杰金式淋巴瘤细胞系Raji细胞的增殖抑制作用、诱导凋亡作用,同时也比较了DADS对这3种细胞活性氧产生以及Rac2的表达的影响。为进一步阐明DADS诱导肿瘤细胞凋亡的机制,为肿瘤细胞的诱导凋亡治疗提供新思路。
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siRNA沉默Rac2蛋白表达下调树突状细胞的交叉递呈
目的 通过RNA干扰研究Rac2蛋白对树突状细胞(DC)交叉递呈的影响.方法 首先构建针对Rac2基因siRNA的慢病毒载体pFIVsiRNARac2-1,pFIVsiRNARac2-2,pFIVsiRNARac2-3;DNA-磷酸钙共沉淀的方法转染293FT细胞包装慢病毒,嘌呤霉素(puromycin)筛选病毒感染的阳性DC2.4(树突状细胞系),Western-blot检测其干扰效率;然后用B3Z细胞(H2-Kb限制性,SIINFEKL特异性T细胞杂交瘤)检测筛选后的DC2.4细胞交叉递呈的能力.结果 酶切和测序结果证实表达siRNA的慢病毒载体构建成功,抗原递呈实验发现下调了Rac2蛋白表达的DC2.4细胞交叉递呈能力下降.结论 初步证实了Rac2蛋白参与树突状细胞对外来抗原的交叉递呈,为进一步了解树突状细胞交叉递呈的分子机制奠定了基础.
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Rac2在二烯丙基二硫诱导人白血病K562细胞凋亡中的作用
目的：研究二烯丙基二硫（diallyl disulfide ，DADS ）诱导人白血病K562细胞凋亡的分子机制。方法 Real-time PCR检测Rac2基因mRNA水平；Western blot检测Rac2、JNK、p38等蛋白的表达；基因沉默Rac2蛋白的表达；流式细胞术检测凋亡细胞百分率以及细胞内的活性氧（reactive oxygen species ，ROS）水平；琼脂糖凝胶电泳检测晚期凋亡。结果随着DADS质量浓度的增加，Rac2基因mRNA水平明显上调（P＜0．05）。与未干扰组相比，siRac2 RNA组凋亡率明显降低（P＜0．05）。Rac2 siR-NA干扰的DADS诱导的 K562细胞并未出现梯状条带。与未干扰组相比，siRac2 RNA组在5．0，10．0和15．0 mg · L-1 DADS作用于K562细胞8 h后，荧光强度显著降低（P＜0．05）。Western blot分析结果显示：与对照组相比，10．0和15．0 mg · L-1 DADS作用于K562细胞24 h后，蛋白 Rac2的表达水平明显上调（P＜0．05）；用 siRNA抑制Rac2蛋白的表达后，JNK1的表达显著降低，p38和磷酸化的p38的表达在Rac2干扰前后没有明显变化。结论 Rac2与DADS诱导K562细胞凋亡、活性氧的产生密切相关。活化的Rac2选择性地激活JN K信号通路而不是p38信号通路导致细胞凋亡。
