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DNA聚合酶-Ⅰ Klenow片段原位检测缺血性神经元的DNA早期断裂
目的 探讨脑缺血30 min后DNA断裂损伤的发生时间.方法 用DNA聚合酶-Ⅰ Klenow大片段原位检测缺血性神经元的DNA早期断裂.结果 缺血再灌注1 h顶叶皮层、梨状皮层出现DNA断裂,再灌注2 h尾壳核出现DNA断裂,再灌注24 h,各个区域的DNA断裂均达到顶峰.结论 DNA断裂损伤可能是缺血神经元改变的早期事件之一.
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利用套叠PCR技术合成人胰岛素原基因的临床研究
目的 设计并分子克隆适宜于大肠杆菌表达系统的人胰岛素原基因.方法 以美国国家基因库(GenBank)发布的人胰岛素原的氨基酸序列为模板,参考大肠杆菌表达系统的密码子偏好性以及所用表达载体(pCEX一3x)的特点,经计算机分析、设计人胰岛素原基因为8个寡核苷酸片段,以重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术体外延伸获得完整的人胰岛素原基因,分子克隆后测定所得基因的核苷酸序列.结果 经限制性内切酶分析确定为重组克隆的质粒进行核苷酸序列分析,结果 表明,我们所克隆的基因序列完全符合我们先前的设计.结论 SOE-PCR技术可用于体外寡核苷酸片段的延伸并获得完整长度的基因.Taq DNA聚合酶延伸反应前以Klenow片段处理可提高较短覆盖末端或较低专一性末端正确延伸的成功率.
关键词： 套叠PCR(SOE-PCR) 人胰岛素原 Klenow片段 基因克隆 -
利用pfu聚合酶进行高效率DNA末端补平研究
在进行基因工程的研究中,通常要将克隆的目的基因在一个特定的宿主系统中表达,并要求目的基因的表达水平较高.为此,首先必须选用一个具有高效表达潜力的表达载体.但由于现有商业载体的种类限制,载体中往往缺少可供使用的限制性内切酶位点.这种情况下,只能利用各种手段使载体和要连接的外源基因产生平末端,然后进行平末端连接.
关键词： Klenow片段 pfu DNA聚合酶 末端补平 -
DNA聚合酶-I Klenow片段原位检测缺血性神经元的DNA早期断裂
1 材料和方法1.1 材料 雄性4 mo龄左右SD大鼠36只，体质量250～350 g, 本校实验动物中心提 供 ；DNA聚合酶-I Klenow大片段、biotin-dATP, dGTP, dCTP, dTTP购自美国Gibco公司.1.2 脑缺血模型 按文献［1］方法建立前脑缺血模型.1.3 动物分组及组织切片制备 36只大鼠随机分组，实验组每组4只，假 手术对照组每组2 只，分缺血再灌注1, 2, 3, 6, 24和72 h 6个时间点，各组于相应时间点取脑，将其快速包 埋于干冰中，选择视交叉部位切片，片厚10 μm，储存于-70℃冰箱备用.1.4 方法 玻片晾干，在40 g.L-1多聚甲醛固定30 min, 0.01 mol.L-1 PB S漂洗5 min×3次；在37℃湿温箱中，用含有10 μmol.L-1的dGTP, dCTP, dTTP标记 的dATP和40 U.mL-1的E.coli Klenow片段及50 mmol.L-1 Tris-HCl, 1 0 mmol.L-1 MgCl2, 50 mmol.L-1 NaCl的混合液(pH 8.0)孵育1 h, 0.01 mol.L-1的PBS液终止反应，然后在PBS/小牛血清白蛋白(0.5 g.L-1)中洗5 m in，再将生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物(ABC 1∶300, Sigma)在PBS/小牛血清白 蛋白中孵育1 h，后用0.5 g.L-1 DAB在PBS (0.01 mol.L-1 pH 7.4)和0.5 g.L-1 H2O2中显色.
