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MiR-34a对人脐静脉内皮细胞端粒酶活性的影响
目的 研究miR-34a对脐静脉内皮细胞端粒酶活性及细胞衰老的影响.方法 原代培养人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),通过传代培养,计算细胞群体倍增水平(Population doublings,PDL),得到年轻的内皮细胞(PDL8)及衰老细胞模型(PDL44),检测两组细胞SIRT1、hTERT、c-myc、p53及miR-34a表达水平的差异.并在PDL8细胞中过表达miR-34a,PDL44细胞中抑制miR-34a的表达,qPCR检测以上基因表达水平、TRAP-qPCR法检测端粒酶活性、SA-β-gal法显示细胞衰老状态的变化.结果 SIRT1、hTERT、c-myc基因在PDL44的HUVECs细胞中表达下调,p53及miR-34a表达上调.PDL8 HUVECs过表达miR-34a 48h后,SIRT1和hTERT表达分别下调43％和25％,TRAP-qPCR显示端粒酶活性降低21％,SA-β-gal法染色阳性细胞百分比由5.1％上升至8.7％;PDL44 HUVECs抑制miR-34a的表达,SIRT1和hTERT表达水平分别上调63％和30％,端粒酶活性上升20％,SA-p-gal法染色显示衰老细胞数量未见显著性变化.结论 MiR-34a可以抑制内皮细胞SIRT1、hTERT基因表达及端粒酶活性,加速细胞衰老;抑制miR-34a可以上调SIRT1及hTERT表达,端粒酶活性升高;因此miR-34a可能通过抑制SIRT1表达和端粒酶活性的共同作用,参与内皮细胞衰老的调节.
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MicroRNA-181b诱导血管内皮细胞衰老和功能异常的机制研究
目的 研究microRNA-181b (miR-181b)和胰岛素样生长因子1受体(Insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)参与血管内皮细胞衰老和血管新生的调节机制.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),传代培养计算细胞群体倍增水平(Population doublings,PDL),将PDL ≤ 8 HUVECs定义为年轻细胞,PDL≥44 HUVECs定义为衰老细胞,并检测miR-181b和IGF1R在年轻(PDL8)和年老(PDL44) HU VECs中的表达.PDL8 HUVECs过表达或抑制miR-181b后,分别用MTS比色法、划痕(Wound healing)和成管(Tube formation)实验检测内皮细胞的增殖、迁移、成管等血管新生能力.采用双荧光素酶报告系统法检测miR-181b对IGF1R转录后水平的调控.此外,给予缺氧刺激,观察缺氧应激条件下miR-181b对IGF1R表达的调控作用.结果 过表达miR-181b可抑制PDL8内皮细胞的增殖能力22％ (P＜0.001)、迁移能力23％ (P＜0.001),对成管能力没有显著影响(P＞0.05).与PDL8HUVECs比较,miR-181b在PDL44衰老内皮细胞中上调64％ (P=0.046),IGF1R的mRNA和蛋白水平分别下调39％和45％ (P=0.004,P=0.014).荧光素酶活性实验显示miR-181b可与IGF1R的3'UTR结合,但过表达miR-181b对IGF1R的表达水平无显著影响(P＞0.05).在缺氧应激条件下,miR-181b可上调IGF1R的表达(P=0.005).结论 MiR-181b抑制血管内皮细胞增殖、迁移等血管新生能力,这一作用与miR-181b在缺氧应激条件下上调血管发育相关基因IGF1R的表达相关,其机制仍需进一步研究.
关键词： microRNAs 内皮细胞衰老 血管新生 胰岛素样生长因子1受体 -
阿司匹林抗高糖诱导内皮细胞衰老过程中对一氧化氮-一氧化氮合酶系统的影响
目的 探讨阿司匹林是否通过影响一氧化氮(NO)-一氧化氮合酶(NOS)系统发挥抗高糖诱导的内皮细胞衰老的作用. 方法 人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)分别于正常糖浓度培养液(5.5 mmol/L)、高糖培养液(33 mmol/L)、含阿司匹林(0.01～1mmol/L)培养液及含L-NAME(300 μmol/L)培养液中培养48 h.采用β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色鉴定衰老细胞,流式细胞仪检测细胞内活性氧簇(ROS)水平.Griess法检测细胞总NO水平,荧光酶标仪检测细胞内NOS活性.Westernblot分析eNOS蛋白及eNOS人丝氨酸(Ser-1177)蛋白表达. 结果 高糖作用内皮细胞48 h后与正常糖浓度相比,SA-β-gal阳性细胞数明显增多.阿司匹林剂量依赖性地减少SA-β-gal阳性细胞数,降低ROS的水平,升高NO的水平、总NOS活性和eNOS Ser-1177蛋白表达(P＜0.05).L-NAME(NOS的抑制剂)能完全抑制高糖环境下阿司匹林的上述作用(P＜0.05).各组间eNOS总蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 高糖环境下阿司匹林通过提高细胞NOS活性而升高NO水平,降低氧化应激反应而发挥抗衰老作用.
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补肾活血方对动脉粥样硬化新西兰兔miRNA-217/Sirt1/FoxO1信号通路的影响
目的 观察补肾活血方对动脉粥样硬化新西兰兔MicroRNA-217(miRNA-21 7)/沉默信号调节器1(Sirt1)/叉头转录因子(FoxO1)信号通路的影响.方法 将新西兰兔44只随机分为对照组、模型组、补肾活血方组和阿托伐他汀钙组,除对照组外,其余3组高脂饲料喂养16周,灌胃8周后实时荧光定量PCR检测miRNA-217基因表达水平,免疫印迹实验检测Sirt1、FoxO1蛋白表达水平.结果 与模型组相比,补肾活血方组和阿托伐他汀钙组miRNA-217表达降低(P＜0.01),Sirt1、FoxO1表达增高(P＜0.01).补肾活血方组miRNA-217水平低于阿托伐他汀钙组(P＜0.05),Sirt1蛋白水平高于阿托伐他汀钙组(P＜0.05).结论 补肾活血方可能通过调控miRNA-217/Sirt1/FoxO1信号通路延缓内皮细胞衰老从而起到抗动脉粥样硬化作用.
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MicroRNA-21介导非对称性二甲基精氨酸诱导的内皮细胞衰老
目的:观察非对称性二甲基精氨酸(ADMA)对内皮细胞中microRNA-21(miR-21)表达的影响,探讨microRNA-21在ADMA诱导的内皮细胞衰老中的作用.方法:人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与10 uM的ADMA孵育48小时后收集细胞提取总RNA及蛋白,荧光定量实时RT-PCR检测miR-21表达,Western blot检测超氧化物歧化酶2(SOD2)表达,衰老相关半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色鉴定衰老的内皮细胞;然后HUVEC与miR-21抑制剂转染6小时后继续与10uM的ADMA孵育48小时留取细胞按上述方法检测相关指标.结果:HUVEC与ADMA孵育后miR-21表达量明显增加(P＜0.01),同时衰老的内皮细胞数量增多(P＜0.05),而SOD2表达减少(P＜0.01);MiR-21抑制剂转染HUVEC后ADMA诱导的miR-21表达明显减少,同时衰老的内皮细胞减少,而SOD2表达明显增加(所有P＜0.01).结论:ADMA诱导了HUVEC中miR-21表达及细胞衰老,miR-21介导了ADMA诱导的内皮细胞衰老作用,其机制可能与其抑制SOD2表达有关.
关键词： MicroRNA-21 ADMA 内皮细胞衰老 -
阿司匹林抗高糖诱导的内皮细胞衰老的作用
目的 探讨阿司匹林是否具有抗高糖诱导的内皮细胞衰老的作用及其机制.方法 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分别于正常糖浓度培养液(5.5 mmol/L)、高糖培养液和高糖(33 mmol/L)+阿司匹林(0.01、0.1、1及3 mmol/L)培养液中培养48 h,观察细胞形态、采用β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞,PCR-ELISA检测端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞周期和细胞内活性氧水平.结果 高糖培养液作用HUVEC 48 h后,细胞呈现衰老状态,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数明显增加,端粒酶活性明显减低,细胞周期停滞于G0/G1期,S期显著减少,细胞内活性氧水平显著增加.0.01、0.1和1 mmol/L阿司匹林作用后细胞形态改善,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数显著减少,端粒酶活性增强,S期细胞显著增加,细胞内活性氧水平降低(P＜0.05).而3 mmol/L阿司匹林作用后与高糖组相比差异无显著性.结论 高糖环境下阿司匹林(0.01、0.1和1 mmol/L)具有抗内皮细胞衰老的作用,其作用机制可能与氧化应激有关.
