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两株鼠抗人GL50单克隆抗体的制备及其生物学特性的初步研究
目的研制鼠抗人GL50分子单克隆抗体并对其生物学特性进行初步研究. 方法以天然高表达人GL50分子的Daudi细胞为免疫原,人GL50-L929转基因细胞为目的单克隆抗体(McAb)的筛选细胞,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,获得分泌特异性鼠抗人GL50分子McAb的杂交瘤细胞株;免疫荧光标记和流式细胞术分析McAb识别GL50的表达;Western blot检测抗体对特异性细胞膜蛋白的识别;台盼蓝(Trypan blue)染色细胞计数法和MTT法检测McAb对Daudi 细胞体外生长的抑制作用;3H-TdR法检测抗体对GL50-L转基因细胞介导的活化T细胞体外增殖的效应. 结果成功制备2株分泌特异性抗人GL50抗体的杂交瘤细胞株12B11和11C4;两者皆为IgG2a亚型;腹水效价皆在1∶1000以上;12B11、11C4特异性地识别GL50分子.11C4 McAb可以明显抑制Daudi细胞在体外的生长,并可抑制GL50-L转基因细胞介导的活化T淋巴细胞的体外增殖效应. 结论成功获得了2株特异性鼠抗人GL50抗体,其中11C4 McAb具有诱导表达GL50分子的B淋巴瘤细胞Daudi的体外生长抑制作用;在T淋巴细胞体外增殖反应中发挥了重要的调节作用.
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ICOS/GL50信号在T细胞依赖性体液免疫应答中的作用
研究ICOS/GL50信号在T细胞体外增殖、细胞因子分泌以及B细胞抗体分泌中的作用,进一步探讨该信号途径在机体体液免疫应答中的作用机制.采用3H-TdR检测GL50-L929转染细胞和特异性鼠抗人GL50单抗对T细胞体外增殖的作用;ELISA法检测GL50-L929转染细胞和抗人GL50单抗对T细胞分泌IL-2、IL-10以及ICOS-L929转染细胞和特异性鼠抗人GL50单抗对PWM介导的B细胞分泌抗体的效应.结果提示GL50-L929转染细胞能够促进经抗CD3单抗活化的T细胞增值和分泌IL-10,而抗GL50单抗可以阻断这些效应.ICOS分子与B细胞上GL50分子的结合上调PWM介导的B细胞分泌抗体而抗GL50单抗则下调这一效应.这些表明,ICOS/GL50信号途径在机体T细胞依赖的体液免疫应答反应中发挥着重要的调节作用.
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转染人GL50基因细胞株的建立及其对T细胞体外增殖与活化的促进作用
目的:建立稳定表达人协同刺激分子GL50的转基因细胞,探讨其体外对T细胞活化与增殖的协同刺激效应.方法:RT-PCR法从人B淋巴瘤Daudi细胞中克隆人GL50编码区全长基因,经EcoR I和BamH I双酶切后插入pIRES2-EGFP真核表达载体,构建pIRES2-EGFP-GL50重组子.用脂质体法转染小鼠成纤维L929细胞株,经G418长期加压筛选,免疫荧光标记和流式细胞术分析GL50分子在L929/GL50细胞膜上的表达,CCK-8法和酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析L929/GL50转基因细胞对T淋巴细胞体外增殖与活化的影响.结果:成功建立稳定表达GL50分子的L929/GL50转基因细胞.该转基因细胞在体外能显著地促进T细胞增殖;促进T细胞的活化及其对IL-4、IL-10和IL-17等细胞因子的分泌.结论:ICOS/GL50信号在机体免疫应答过程中发挥了重要作用,GL50转基因细胞的成功构建为进一步研究ICOS/GL50分子的生物学功能奠定了物质基础.
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GL50分子在单核细胞来源树突状细胞上的表达及其逆向信号对树突状细胞体外分化成熟的促进作用
目的 分析GL50在不同分化时期单核细胞来源树突状细胞(Mo-DCs)上的表达,探讨GL50信号对Mo-DCs的生物学作用.方法 用Ficoll 密度离心及贴壁法获得外周血单核细胞,经GM-CSF+IL-4常规方法诱导,并分别加入丝裂霉素处理的mock-L929和ICOS-L929细胞,6 d时,加入或不加入TNF-α培养3 d后收集细胞;另外,在上述ICOS-L929细胞处理组的单核细胞中加入不同浓度的GL50单克隆抗体11C4或小鼠同型IgG,加入或不加入TNF-α,继续培养3 d后,收集细胞,免疫荧光标记和流式细胞术分析Mo-DCs表型(GL50、CD80、CD83、CD86)、摄取FITC-Dextran抗原的能力;混合淋巴细胞反应检测Mo-DCs对T细胞的作用;ELISA方法检测对分泌细胞因子IL-2、IL-10的影响.结果 GL50分子在不成熟Mo-DCs上高表达,而随着Mo-DCs的成熟呈下调性表达;GL50单克隆抗体11C4能够有效地促进Mo-DCs的成熟,上调Mo-DCs表面分子(CD86、CD80、CD83、HLA-DR)的表达,降低Mo-DCs摄取FITC-Dextran的能力,同时能有效地促进细胞因子IL-10的分泌,而对IL-2的分泌没有显著影响.结论 GL50分子介导的逆向信号参与了Mo-DCs分化成熟的调节,GL50/ICOS是参与DC/T细胞相互作用的主要分子.
