首页 > 文献资料
-
10-23 DNAzyme对乙型肝炎病毒X基因表达的抑制作用
目的 以增强绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告分子,探讨10-23 DNAzyme对乙型肝炎病毒(HBV)X基因表达的抑制作用.方法 设计并合成3种能针对HBV X基因的特异性10-23DNAzymes,分别命名为DrzHBVX-7、DrzHBVX-8和DrzHBVX-9,能分别特异地识别HBV X基因开放阅读框(ORF)的A1376UG.将内有HBV X全基因片段(不含终止密码)的融合表达质粒pHBx-EGFP与10-23DNAzyme共转染AD293细胞作为共转染组,用pHBx-EGFP单独转染AD293细胞作为对照组,分别用荧光显微镜观察并用流式细胞仪检测细胞荧光强度,同时用半定量一步法RT-PCR分析融合荧光蛋白HBx-EGFP mRNA的相对表达量.结果 各共转染组细胞荧光蛋白HBx-EGFP的表达均明显弱于对照组(P＜0.05);各试验组HBx-EGFP mRNA的相对表达量与对照组比较也均明显减少(P＜0.05);各共转染组细胞之间HBx-EGFP的表达及HBx-EGFP mRNA的相对表达量差异无统计学意义(P＞0.05).结论 10-23 DNAzyme对HBV X基因的表达有特异抑制作用,在HBV感染的基因治疗中会有潜在的应用价值.
-
bcr启动子驱动增强绿色荧光蛋白表达转基因小鼠的制备和初步鉴定
目的 制备bcr启动子驱动-增强绿色荧光蛋白(bcr-EGFP)转基因小鼠模型,在活体水平验证bcr启动子的启动特异性.方法 以慢性髓性细胞白血病(CML)细胞株K562细胞基因组为模板,PCR扩增1.1 kb bcr启动子,在扩增产物的上、下游引物加入了Ase Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切位点,AseⅠ、EcoRⅠ双酶切pEGFP-N1真核表达质粒载体,去除载体自身的CMV启动子,并将1.1 kbbcr启动子定向克隆到EGFP绿色荧光蛋白报告基因上游,构建pbcr-EGFP真核表达载体,并将此重组质粒瞬时转染K562细胞和NIH3T3细胞,进行表达验证.显微注射法制备bcr-EGFP转基因小鼠,采用PCR方法进行初步整合检测.结果 显微注射583枚受精卵,移植到30只受体鼠输卵管中,受体鼠妊娠26只,共生产首建鼠90只,经过PCR检测,4#(♀)、36#(♂)和81#(♂)等3只F0代为转基因整合阳性鼠.结论 成功制备了bcr-EGFP转基因小鼠,为进一步研究bcr启动子在CML转基因小鼠模型制备的安全性和可靠性提供线索和帮助.
-
天然型EGFP在无细胞翻译系统中的可溶表达
目的:构建能在无细胞翻译系统中表达天然型增强绿色荧光蛋白(EGFP)的原核表达载体.方法:以质粒pEGFP-N1为模板扩增EGFP基因,NcoI和HindⅢ双酶切EGFP基因和pET28a载体.T4 DNA连接酶连接,转化E.coli DH5α,提取载体,酶切和DNA测序鉴定.正确重组的载体命名为pET28a-EGFP.在无细胞翻译系统中加入大抽后的pET28a-EGFP模板(0.6 mg/ml),孵育3 h.荧光显微镜观察荧光.Western blot鉴定EGFP.结果:测序证实重组EGFP基因序列与基因库中的序列完全一致,荧光显微镜下观察到无细胞翻译系统中强烈荧光,Western blot证实分子量约为27 kD的EGFP高效表达.结论:成功构建了能在无细胞翻译系统中高效表达可溶性天然型EGFP的pET28a-EGFP载体,为进一步建立荧光强度标准物奠定了基础.
关键词： 增强绿色荧光蛋白(EGFP) 重组载体 无细胞翻译系统 原核表达
