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免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法的分析研究
目的 通过对4种体外杀伤检测方法的方法学优化及分析比较,以期寻找到一种可以替代经典51Cr释放法、相对快速、并可用于多种具有杀伤活性免疫细胞的体外杀伤效力评价方法.方法 以自然杀伤性NK细胞系NK-92为效应细胞,以K562细胞为靶细胞,分别对4种体外杀伤检测方法BATDA法、CAM法、CytoTox-Glo法和PKH法的标记条件、杀伤时间、效靶比等参数进行优化,分析每种方法的实验内及实验间可重复性,以及与51Cr释放法的相关性,并初步用于不同靶细胞、效应细胞的广谱性分析.结果 经方法学优化后,4种体外杀伤方法在一定范围内均可显示出杀伤效力与效靶比的相关性,但与其他3种方法相比,CytoTox-Glo法在高效靶比时(40∶1)表现出明显的倒钩效应;4种方法中,BATDA法的检测时间短,NK-92细胞与K562细胞作用1 h即可检测出明显的杀伤效力,CAM法及PHK法基本上都需要作用4 h才能测出明显的杀伤效力,而CytoTox-Glo法可能需要6～8 h才能看出明显的杀伤结果;4种方法的实验内与实验间可重复性均相对较好,其中BATDA法及CAM法表现出更好的可重复性;4种方法与51Cr释放法均具有一定的相关性,但BATDA法与51Cr释放法曲线的拟合度更好;与其他3种方法相比,BATDA法可用于贴壁性的靶细胞Caov3的杀伤效力检测,且在自体NK细胞和CD19-CAR T细胞的杀伤检测中亦显示出较好的结果.结论与其他3种方法相比,BATDA法的检测结果与51Cr释放法的线性相关性好,作用时间短、方法的可重复性好,并且对贴壁性靶细胞的检测也比其他方法有优势,BATDA法具有替代51Cr释放法用于NK及其他免疫细胞的体外杀伤效力评价的应用前景.
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EpCAM特异性免疫效应细胞对EpCAMhigh腺癌细胞的体外杀伤实验研究
背景：上皮细胞粘附分子(EpCAM CD326)高表达于多种实体腺癌细胞表面，包括结肠癌、胃癌、乳腺癌等。EpCAM在胃肠道肿瘤细胞>95%，与肿瘤细胞的增殖及肿瘤预后有密切关系。近年来， EpCAM已经成为肿瘤免疫治疗的一个新靶点，培养EpCAM特异性免疫效应细胞(Ep-effector)制备新高效特异性杀伤细胞。目的：探讨体外制备的EpCAM抗原特异性免疫效应细胞的特异性杀伤功能。并比较其与腺癌细胞裂解物特异性免疫效应细胞、CIK细胞杀伤功能的差异。方法：采集健康成人外周血，分离淋巴细胞及imDCs。体外诱导淋巴细胞中T细胞转化为CIK细胞并扩增。本实验首次以纯化EpCAM多肽抗原负载imDCs生成EpCAM-mDCs(Ep-mDCs)，Ep-mDCs与自体CIK细胞体外共培养，制备成纯化EpCAM抗原特异性DC-CIK-CTL效应细胞(Ep-effector)。相似的方法，制备LS174-T腺癌细胞全抗原特异性DC-CIK-CTL效应细胞(LS-effector)。设单纯CIK组、LS-effector组及Ep-effector组，选择EpCAMhighLS174-T结肠腺癌细胞及EpCAMlowPaCa-2胰腺癌细胞作为靶细胞。细胞毒试验(CCK-8法)检测不同效靶比时各组效应细胞对EpCAMhigh的LS174-T及EpCAMlow的PaCa-2的杀伤效率。结果：体外制备LS-mDCs及Ep-mDCs表面分子表达量无差异(P>0.05)。随效靶比(E∶T)增高，各组效应细胞对LS174-T及PaCa-2的杀伤效率均升高。Ep-effector组对LS174-T的杀伤效率高于LS-effector组及单纯CIK组，LS-effector组与单纯CIK组无统计学差异；对PaCa-2的杀伤效率，两两组间比较无统计学差异(P>0.05)。结论：本实验首次应用EpCAM负载人外周血来源DC细胞制备Ep-mDCs，并证实其拥有激活T细胞生成特异性CTL的功能，由其制备的效应细胞(Ep-effector)对EpCAMhigh腺癌细胞具有更高的特异性杀伤活性。
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组蛋白去乙酰化酶抑制剂提高腺病毒对K562细胞转染及杀伤效率的研究
目的 研究通过观察组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对人类白血病细胞系K562柯萨奇-腺病毒受体(CAR)表达水平的影响,并探讨HDAC抑制剂在以腺病毒为载体的基因治疗中的应用价值.方法 在mRNA和蛋白水平检测TSA处理K562细胞前后CAR的表达情况,采用流式细胞术测定病毒的转染效率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测腺病毒及其携带的基因的体外抗瘤效应.结果 TSA处理后,K562细胞CAR的mRNA和蛋白表达明显增高;流式细胞仪分析ADV-GFP转染K562后GFP的表达发现:未处理组的转染率为(8.74±0.34)%,1、10和100 nmol/LTSA处理细胞48h后的转染率分别为(12.26±0.55)%、(20.83±1.22)%和(28.66±0.43)%.未处理组与处理组间及各处理组间转染效率的差异有统计学意义(P《0.05).MTT结果表明腺病毒M1介导的体外杀伤效应TSA处理组比未处理组增强(P《0.05),TSA各处理组间的体外杀伤效应随TSA浓度的提高而增强(P《0.05).结论 低浓度的TSA可以增强腺病毒对K562细胞的感染及杀伤效率,可以提高以腺病毒为载体的血液肿瘤基因治疗的疗效.
