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肺炎链球菌青霉素耐药相关基因研究
目的了解我国肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,Sp)青霉素耐药相关基因的存在与突变状况.方法设计、优化pbp1a、TEM基因PCR检测体系及扩增产物全自动DNA序列测定体系,对3株分离自苏州地区患儿呼吸道的Sp(青霉素低耐株SR017、SR019;青霉素敏感株SR028,3株均苯唑青耐药,且SHV基因均为阴性)进行检测,测得的pbp1a DNA序列与Sp R6株(青霉素敏感株)DNA序列相比较;测得的TEM基因DNA序列与同院原分离的产超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌中检出的TEM-1 DNA序列及已在GenBank登录的TEM基因序列相比较.结果 SR017、SR019、SR028之pbp1a基因均有突变,突变率为21%、21%、0.4%.SR019株TEM基因阴性,SR017和SR028 TEM基因阳性,测得DNA序列分别被证实为TEM-129和TEM-1,前者且是新型TEM,作为新发现的菌种耐药基因均已登录美国国立生物信息中心GenBank,登录号AY452662、AY392531;二者DNA序列与产超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌中检出的TEM高度同源(99.7%、99.8%).结论我国Sp青霉素耐药可能存在产β内酰胺酶(获得TEM基因)和pbp基因突变两种机制,TEM耐药质粒可能在不同种菌株间传播.
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肺炎链球菌pbp1a基因重组原核表达质粒的构建与鉴定
目的 构建肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pneumoniae)pbp1a基因重组的原核表达质粒,并进行鉴定.方法 化学合成S.pneumoniae含STMK区的pbp1a基因片段,PCR扩增后,与pUC19载体连接,构建重组表达质粒pUC19-pbp1a.转化耐青霉素的pbp1a基因突变的S.pneumoniae,测定青霉素对转化菌的低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC),以鉴定PBP1a的活性；SDS-PAGE和Western blot分析重组PBP1a蛋白的表达.结果 pbp1a基因扩增产物可见约330 bp的特异条带,大小与预期一致,测序表明重组质粒全长360 bp,无碱基的缺失、插入等突变；青霉素对转化菌的MIC从8μg/ml下降为2μg/ml;表达的重组PBP1a蛋白相对分子质量约为11 000,可与抗S.pneumoniae青霉素敏感株兔血清特异性结合.结论 成功构建了S.pneumoniae pbp1a基因重组原核表达质粒,其能在S.pneumoniae中表达有活性的PBP1a蛋白,为进一步研究PBPs在细菌耐药变异中的作用提供了实验材料,也为进一步探讨消除细菌耐药性变异的措施奠定了基础.
