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TM-TNF-α介导的反向信号协同增强sTNF-α对U937细胞的激活作用
目的用sTNFRⅠ预先激活TM-TNF-α介导的反向信号,观测其对sTNF-α激活单核细胞系U937细胞的影响. 方法预先用sTNFRⅠ与U937细胞作用30 min,洗涤后加入sTNF-α作用不同时间,观测预激活反向信号对sTNF-α刺激U937产生活性氧、胞内促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-8 mRNA的转录及IκB-α水平(Western blot)的影响. 结果单独用sTNFRⅠ激活的反向信号并不影响U937细胞的功能,而预激活反向信号能协同增强sTNF-α刺激U937细胞产生活性氧,且呈sTNFRⅠ浓度、sTNF-α浓度依赖关系;预激活反向信号协同增强sTNF-α刺激U937炎性细胞因子mRNA(TNF-α、IL-1β、IL-8等)的转录水平;并促进U937细胞IκB-α的降解. 结论预先激活TM-TNF-α介导的反向信号协同增强sTNF-α对U937的激活作用,提示反向信号可能参与机体对早期炎症反应的调节.
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跨膜型TNF-α介导的反向信号对NK细胞杀伤功能的影响
目的:观察跨膜型TNF-α介导的反向信号对NK细胞杀伤功能的影响.方法:用sTNFRI激活NK92细胞的TM-TNF-α反向信号;MTT比色法检测NK92细胞对靶细胞的杀伤作用;β-己糖氨酶释放实验检测NK92细胞在杀伤靶细胞时的胞吐作用;ELISA实验检测NK92细胞sTNF-α的分泌;流式细胞术检测NK92细胞FasL的表达.结果:预先激活TM-TNF-α反向信号,可以促进NK92细胞对靶细胞的杀伤功能;增强NK92细胞的胞吐;促进FasL的表达和sTNF-α的分泌.结论:TM-TNF-α反向信号可能通过促进NK92细胞胞吐、sTNF-α分泌及FasL的表达而促进NK92细胞对靶细胞的杀伤.
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ICOS/ICOSL逆向信号诱导成熟过程中树突状细胞特异性分泌TGF-β1
目的:分析可诱导共刺激分子(ICOS)能否向成熟过程中树突状细胞(DCs)传递逆向信号及其对DCs功能的影响.方法:取小鼠骨髓细胞,体外诱导培养、纯化第5天不成熟DCs,以ICOSIg或对照IgG加LPS或CpG处理后,流式细胞仪检测DCs表型分子、吞噬功能及胞内细胞因子改变;以ELISA检测培养上清细胞因子变化;以[3H]-TdR掺入法探讨DCs抗原递呈功能.结果:与IgG对照组相比,ICOSIg联合LPS或CpG处理组DCs 分泌TGF-β1的表达明显升高;ICOSIg作用于成熟过程中DCs,其吞噬功能与对照IgG相比近似或略有增强,但其抗原递呈功能受到部分抑制,可引起T细胞中IL-2、IL-10明显升高.结论:ICOS作用于成熟过程中的DCs后,促进DCs特异性分泌TGF-β1、部分抑制了DCs的抗原递呈功能,其机制可能是诱导了产IL-10 CD4+T细胞的生成;这种反向信号在不同机制诱导DCs成熟的过程中均可能存在.
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TM-TNF-α介导的反向信号下调sTNF-α激活后U937细胞因子mRNA的表达
目的:观测TM-TNF-α介导的反向信号对sTNF-α激活后U937细胞因子mRNA的影响,构建TM-TNF-α胞浆段缺失突变体,并进一步验证.方法:sTNF-α激活U937细胞后撤除,加入可溶性TNFR(sTNFRⅠ)激活TM-TNF-α介导的反向信号,用RT-PCR方法检测反向信号对活化后U937细胞因子IL-1β、IL-8 mRNA的影响;采用分子克隆技术构建TM-TNF-α胞浆段缺失突变重组体,采用电穿孔法转染U937,并用Western blot检测蛋白表达.结果:sTNF-α激活U937细胞后撤除,高表达的细胞因子IL-1β、IL-8 mRNA随着时间的延长而逐渐降低;sTNFRⅠ激活的TM-TNF-α介导的反向信号可加速细胞因子mRNA的降解,且使mRNA降解至50%的时间分别由约75、60分钟缩短至约45、35分钟.成功构建TM-TNF-α胞浆段缺失突变重组体pcDNA3.0-ΔcsTM-TNF-α并瞬时转染U937细胞,Western blot结果显示U937细胞膜表面除表达26 000的野生型TM-TNF-α蛋白外,还可表达约20 000的突变体蛋白.这种缺失胞浆段的突变体蛋白可竞争性抑制反向信号对活化后U937细胞因子mRNA的下调作用.结论:TM-TNF-α介导的反向信号可下调sTNF-α激活后U937细胞因子mRNA的表达;且TM-TNF-α胞浆段为其介导的反向信号所必需.
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跨膜型TNF-a突变体(△-28)的正向和反向信号对U937细胞的作用
目的 观察跨膜段突变TM-TNF-a(△-28mTM-TNF-a)正反向信号诱导U937促炎因子表达的影响.方法 △-28mTM-TNF-a质粒分别转染COS-7,检测表达的△-28mTM-TNF-a诱导U937产生N0的量.同样△-28mTM-TNF-a质粒转染U937,sTNFRI激活反向信号后,检测U937促炎因子IL-8以及IL-1β的mRNA转录水平.结果 △-28mTM-TNF-a不能够诱导U937产生NO,但被激活并传递反向信号促使U937的促炎因子转录和表达.结论 跨膜段突变抑制了TM-TNF-a正向信号但不影响反向信号的传递.
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跨膜型肿瘤坏死因子-α胞内段基序稳定表达细胞株的建立及功能研究
目的 建立高表达跨膜型肿瘤坏死因子-α胞内段(TNF-intracellular domain,TNF-ICD)基序的人乳腺癌MCF-7细胞株,为研究TM-TNF-α的反向信号提供工具.方法 采用脂质体介入法将含人TNF-ICD的pIRES2-EGFP病毒载体导入MCF-7中,经鉴定、筛选获得能稳定表达TNF-ICD细胞株.采用MTT法检测转染细胞对TNF-α的敏感度,比色法检测NO含量,ELISA方法 检测NF-κB的活性.结果 TNF-ICD基因转染入MCF-7细胞后表达在细胞膜上,并能提高该细胞NF-κB活性,抵抗TNF-α的杀伤,增加其NO产生;应用NF-κB抑制剂PDTC处理后能恢复该细胞对TNF的敏感性.结论 获得稳定表达TNF-ICD的MCF-7细胞株,TNF-ICD可能作为TM-TNF-α细胞内的一段活化基序参与TM-TNF-α的反向信号,并通过活化NF-κB,抵抗可溶性TNF-α介导的细胞毒作用,增加NO的产生.
关键词： 跨膜型肿瘤坏死因子-α胞内段基序 NF-κB 反向信号 MCF-7细胞
