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BJAB细胞在转导6A8 α-甘露糖苷酶的反义DNA后发生oncosis样死亡
目的采用形态学和分子生物学方法,分析转导6A8 α-甘露糖苷酶的反义DNA导致的B细胞株BJAB死亡的性质. 方法用Giemsa染色、annexin-Ⅴ荧光染色、梯形DNA电泳以及透射电子显微镜等方法,分析细胞死亡的性质;应用Con A结合试验,检测转基因细胞6A8 α-甘露糖苷酶活性的改变;应用Fluo-3探针测定细胞胞浆[Ca2+]i. 结果用重组腺相关病毒(rAAV)颗粒成功地将反义6A8 DNA转导入了EB病毒转化的B细胞株BJAB.在克隆中,转导反义6A8 DNA的BJAB细胞在生长到3～10个细胞时死亡,而野生型、转导空载或转导正义6A8 DNA的BJAB细胞生长良好.转导反义6A8 DNA的BJAB细胞呈聚集状生长,且有大量细胞肿胀,终死亡.Giemsa染色光镜观察、annexin-Ⅴ荧光染色、梯形DNA电泳及透射电镜观察结果表明,这种死亡是一种oncosis(肿胀死)样死亡.Con A结合试验表明,BJAB细胞在转导反义6A8 DNA后的结合率升高,而转导正义6A8 DNA后的结合率则下降.另外,转导反义6A8 DNA的细胞胞浆[Ca2+]i升高. 结论转导反义6A8 DNA引起BJAB细胞发生oncosis样死亡,这种死亡可能与6A8 α-甘露糖苷酶表达被抑制有关.
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CD20特异性启动子调控腺病毒分泌stTRAIL对淋巴瘤细胞的抑制作用
目的:研究腺病毒携带CD20启动子调控的TRAIL基因特异性杀伤B-NHL细胞的作用.方法:人工合成含有CD20启动子片段-分泌信号-异亮氨酸拉链-sTRAIL(aa114 ～ aa281)-真核poly(A)序列的融合基因,装入腺病毒载体AdEasy系统,包装出携带P20-stTRAIL序列的腺病毒感染细胞,采用荧光素酶报告基因法研究CD20启动子在CD20+细胞系中的特异性转录,Western blotting验证TRAIL蛋白在细胞内的特异性表达,体外MTT法检测TRAIL特异性抑制CD20+细胞生长的作用.结果:成功构建携带P20-stTRAIL序列的腺病毒载体并分别感染CD20阳性和阴性淋巴瘤细胞系后发现,CD20启动子仅在CD20+的BJAB淋巴瘤细胞中具有转录活性、启动sTRAIL表达并在体外形成具有生物学功能的同源三聚体结构;在细胞中和培养上清中均检测到stTRAIL在mRNA和蛋白水平的表达,但在CD20细胞系中则无明显表达.体外功能实验显示,B JAB细胞在被AdP20-stTRAIL感染后自身生长受到明显抑制,而AdP20-stTRAIL感染的CD20阴性细胞以及空白载体感染的细胞未见生长抑制现象.结论:CD20启动子可以特异性调控腺病毒携带的治疗基因stTRAIL的表达,实现TRAIL对CD20+B-NHL细胞的靶向杀伤.
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强化融合蛋白抗CD20(Fab)-力达霉素对淋巴瘤BJAB细胞增殖和DNA损伤的作用
目的 研究强化融合蛋白抗CD20(Fab)-力达霉素(LDM)体外对CD20表达阳性的淋巴瘤细胞株B JAB增殖和DNA损伤的作用.方法 流式细胞术检测融合蛋白抗CD20(Fab)-力达霉素辅基蛋白(LDP)与BJAB细胞的结合活性；激光共聚焦显微镜观察融合蛋白抗CD20(Fab)-LDP靶向结合B JAB细胞情况；MTF法检测强化融合蛋白抗CD20(Fab)-LDM对BJAB细胞的生长抑制作用；单细胞凝胶电泳(SCGE)检测强化融合蛋白抗CD20(Fab)-LDM对DNA的损伤；流式技术检测强化融合蛋白抗CD20(Fab)-LDM诱导BJAB细胞的细胞周期的改变.结果 融合蛋白抗CD20(Fab)-LDP与BJAB细胞结合活性为阳性；激光共聚焦显微镜下观察,融合蛋白抗CD20(Fab)-LDP靶向结合在BJAB细胞表面；强化融合蛋白抗CD20(Fab)-LDM作用于淋巴瘤BJAB细胞后,可以显著抑制BJAB细胞的生长,引起DNA损伤,诱导S期阻滞.结论 强化融合蛋白抗CD20(Fab)-LDM可以靶向结合淋巴瘤BJAB细胞,并且具有显著的生长抑制作用,其作用机制是引起DNA的损伤.
