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血小板膜受体糖蛋白Ⅰb-Ⅸ-Ⅴ复合物在瞬时转染的HEK 293T细胞中的异常表达
血小板膜受体糖蛋白(glycoprotein,GP) Ⅰb-Ⅸ-Ⅴ复合物在血小板活化过程中起到关键作用,因此其结构及功能一直是研究的热点和难点.由于血小板缺乏细胞核,研究者通常需将野生型或突变型的GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ基因转染至其他哺乳动物细胞系中(如CHO、HEK 293T等)以研究其结构与功能,因此GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ复合物在这些细胞系中是否能如实的反映其在血小板中的情况,是决定这些细胞系是否适合GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ复合物研究的关键.本研究通过检测GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ复合物在不同细胞系中的表达情况,明确细胞系差异是否可能干扰复合物的表达,进而找出研究GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ复合物的适细胞系.在不同种属、不同组织来源的常用细胞系(如CHO、HEK 293T、HeLa等)中单独或共转染GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ复合物的亚基,并用流式细胞术检测GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ复合物在膜表面的表达量.结果发现:CHO细胞在瞬时转染与稳定转染后GPV在细胞膜表面表达依赖于其与GPⅠb-Ⅸ复合物的相互作用,与血小板中的情况一致.相反,在HEK 293T细胞系中,尽管GPⅠb-Ⅸ复合物的表达情况与CHO细胞及血小板中一致,但是GPV在细胞膜表面的表达不再依赖于GPⅠb-Ⅸ复合物；进一步在HeLa、MES13及HUVEC细胞系中的研究发现,GPV可以在HeLa及MES13细胞膜上独立表达,但是在HUVEC细胞表面不表达,提示GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ复合物各亚基之间的依赖性(进而表现为膜表面的表达量)在不同的细胞系中有所不同.结论:本研究为今后对于GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ复合物的研究具有一定的指导意义,尤其是在细胞系的选择上.HEK 293T细胞系极可能对研究结果造成偏倚,因而并非研究GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ复合物尤其是GPV亚基的佳选择.
关键词： 血小板膜受体 GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ复合物 HEK-293T细胞 CHO细胞 -
稳定表达TRPA1通道的HEK-293 T细胞模型的建立
目的 建立稳定表达TRPA1的HEK-293T细胞模型,并鉴定模型构建是否成功.方法 构建TRPA1真核表达质粒,采用脂质体转染法将其转入HEK-293T细胞中,经G418筛选稳定表达株,采用RT-PCR、免疫组化技术,检测HEK-293T细胞TRPA1基因的转录和蛋白的表达.结果 经酶切、测序证明,TRPA1基因的真核重组表达质粒已成功构建;PCR、免疫组化检测结果表明,将此重组质粒转入HEK-293T细胞可稳定表达TRPA1基因.结论 成功构建了能稳定表达TRPA1通道的HEK-293T细胞株,为体外研究TRPA1生理病理功能和筛选相关TRPA1通道调节剂奠定了基础.
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DNA聚合酶Pol(t)在紫外损伤诱导基因组高突变中的作用
目的 研究DNA聚合酶Polt在紫外损伤耐受及基因组高突变产生中的生物学作用.方法 紫外线照射稳定高表达DNA聚合酶iota(DNA polymerase iota,Pol(t))的HEK293T细胞系(Pol(t)-HEK293T),MTT法检测紫外损伤后细胞的存活率;supF报告基因体内突变检测系统检测基因的突变频率.结果 MTT法结果提示紫外照射后稳定高表达Pol(t)的细胞系与对照组相比细胞存活率没有显著差异;supF报告基因结果显示稳定高表达Pol(t)的细胞系其基因突变频率高于对照组细胞.结论 DNA聚合酶Pol(t)的高表达对紫外损伤后细胞的存活率没有显著影响,不能提高细胞对紫外损伤的耐受,在紫外损伤中pol(t)主要参与诱发体内基因组高突变的产生.
关键词： DNA聚合酶iota HEK-293T细胞 DNA损伤应答 突变
