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microRNA-223调控人胚胎干细胞向树突细胞分化
目的:建立人胚胎干细胞(ESC)向树突细胞诱导分化的新策略,探讨microRNA-223(miR-223)在人胚胎干细胞源树突细胞产生过程中的调控作用及其分子机制.方法:采用人胚胎干细胞在胞外基质Ⅳ型胶原蛋白上直接贴壁培养,加入造血生长因子分步向造血干/祖细胞、共同髓系祖细胞和树突细胞诱导的方案,通过形态学、流式细胞术和造血集落形成实验鉴定分化细胞;人胚胎干细胞经慢病毒转染过表达miR-223或抑制其表达后启动向树突细胞分化,比较不同miR-223表达水平下分化细胞中造血集落形成的数目和表面标记物的表达量;应用双荧光素酶报告基因检测验证TGFBR3是miR-223发挥作用的直接靶标.结果:人ES细胞成功诱导为树突细胞,分化细胞中表达CD83比例可达82％,在整个分化过程中miR-223表达呈上调趋势;添加miR-223模拟物组分化细胞表达CD34+ CD45+、CD34+ CD45+以及CD83+的比例均显著高于添加miR-223抑制剂组和阴性对照组(P＜0.05);添加miR-223抑制剂组分化细胞表达各阶段细胞标记物显著低于阴性对照组(P ＜0.05);添加miR-223模拟物组分化细胞出现大约759个CFU/105细胞数,显著高于其它各组(P＜0.05);双荧光素酶报告基因结果显示,miR-223显著抑制TGFBR3-3'UTR结构的荧光素酶活性(下降了37％)(P＜0.05),而且TGFBR3-3'UTR突变型的荧光素酶活性显著高于野生型(P＜0.01);随着向树突细胞分化成熟,添加miR-223模拟物组分化细胞表达TGFBR3水平逐渐下降,而添加miR-223抑制剂组由于内源性miR-223受到抑制而明显上调TGFBR3的表达.结论:miR-223调控人胚胎干细胞向树突细胞分化,可能通过直接作用于靶标TGFBR3而促进胚胎干细胞源树突细胞的产生.
关键词： 人胚胎干细胞 树突细胞 MicroRNA-223 诱导分化 TGFBR3 -
非小细胞肺癌细胞株TGFBR3基因缺陷表达及其分子机制研究
背景与目的 国外有研究表明,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中转化生长因子受体III(TGFBR3)存在缺陷表达,但是分子机制尚未明确.本研究以正常支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cell,HBEpiC)为对照,分析NSCLC细胞株中TGFBR3基因的表达情况,并探讨TGFBR3基因表达失活的分子机制.方法 采用Western blot检测HBEpiC和NSCLC细胞株中TGFBR3的表达情况并做相对定量分析;采用DNA直接测序检测TGFBR3基因启动子基本转录元件区的突变情况;应用亚硫酸氢钠处理后测序法(bisulfite sequence-PCR, BSP)检测TGFBR3基因启动子区甲基化状态.结果 NSCLC细胞株中TGFBR3表达水平明显低于HBEpiC;高转移细胞株95D明显低于非转移细胞株LTEP-α-2、A549、NCI-H460;HBEpiC与NSCLC细胞株中TGFBR3基因近端启动子区-165到-75区域无遗传突变,且未见甲基化,远端启动子区-314到-199区域均为高甲基化.结论 TGFBR3基因在NSCLC细胞株中表达下调,在高转移细胞株95D中尤其明显,提示该基因的表达缺陷对NSCLC发生发展起重要作用,可能与NSCLC的侵袭和转移相关;然而,TGFBR3基因启动子区重要转录元件区域的甲基化状态并不是导致TGFBR3基因表达下调的主要原因.
