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非基因整合建立人诱导多能性干细胞方法的优化研究
诱导多能性干细胞(iPSC)技术具有临床应用前景,但iPSC的遗传稳定性和成瘤性阻碍了其可能的临床应用.非整合质粒(Episomal)方法无外源基因整合到宿主基因组上并且方法简单,适宜推广,是目前保证iPSC遗传安全性的佳方案之一,但其诱导效率偏低,严重阻碍了其应用.本研究旨在优化Episomal方法,将脐血单个核细胞(CB MNC)重编程为诱导多能性干细胞(iPSC),建立无基因整合的iPSC的高效生成技术体系,为以后建立疾病iPSC奠定基础.利用CB MNC,通过比较不同氧含量,诱导质粒,MNC培养方法和预刺激时间等条件对Episomal方法进行优化.结果表明:CB MNC采用红系培养液,培养8d,使用启动子为SFFV (spleen focus forming virus)的Episomal载体,在低氧(3％)条件下诱导,CB MNC重编程效率高,可达到0.12％.通过分析佳条件下供体细胞成分发现,表型为CD36+ CD71+ CD235alow的有核红细胞是重编程主要的供体细胞来源.结论:本研究成功建立并优化出一种可推广的高效安全的,可以用于临床应用研究的iPSC诱导技术.
关键词： 诱导多能性干细胞 脐血 单个核细胞 Episomal载体 非整合 -
建立非基因整合原发性骨髓纤维化诱导性多能干细胞株
目的:利用诱导多能性干细胞(iPSC)技术建立原发性骨髓纤维化(PMF)诱导多能性干细胞系,为研究血液病的发生发展提供一个实验模型.方法:采用非基因整合型质粒重编程携带JAK2 V617F突变的PMF患者骨髓来源的单个核细胞,诱导生成该患者特异的iPS细胞株.结果:采用此方法建立的iPS细胞株,在体外能够稳定传代,无外源性基因整合,多能性基因表达水平与人胚胎干细胞类似,在体内具有形成三胚层结构的能力.测序结果显示,所建立的患者的iPS细胞株携带不同负荷的JAK2V617F突变.结论:成功地建立非基因整合的PMF患者特异的iPS细胞株,这为研究PMF的发病机制、化疗药物筛选及实现精准化治疗提供了一个重要的疾病模型.
关键词： 诱导多能性干细胞 原发性骨髓纤维化 非整合 Episomal载体 -
用非整合重编程技术构建人外周血单个核细胞来源的诱导多能干细胞
目的 用非整合重编程技术构建人外周血单个核细胞(PBMC)来源诱导多能干细胞(iPSC).方法 收集健康人外周血标本,分离PBMC,用含4个重编程转录因子(OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC)的仙台病毒感染PBMC,并用无饲养层细胞的培养体系培育获得iPSC.通过细胞形态学、碱性磷酸酶(AP)染色、免疫荧光染色、拟胚体形成和分化实验对iPSC细胞进行多能性验证;用核型分析和仙台病毒基因组RNA检测对其进行安全性验证.结果 在仙台病毒感染后16 d后,PBMC出现iPSC样克隆.iPSC可进行传代培养,且经多能性验证实验证明其具有多能性;安全性验证结果表明,iPSC核型正常,外源性病毒基因组RNA可被完全清除.结论 建立了对PBMC进行非整合重编程的诱导体系,并获得了具有多能性、核型正常且不合外源基因的iPSC.
