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隐孢子虫SSU rRNA基因的巢式PCR-RFLP分析
目的建立用巢式聚合酶链反应(Nested PCR)- 限制片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)检测、鉴别微小隐孢子虫(Cryptospordium parvum)和安氏隐孢子虫(C. andersoni)的方法. 方法用巢式PCR技术扩增长春市人和牛粪便中C. parvum与C. andersoni的Small-Subunit rRNA (SSU rRNA)部分基因,并克隆和测序.扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切,进行RFLP分析,并与GenBank上的17株隐孢子虫相应序列进行对比分析和系统发育分析. 结果 C. parvum HCC1、C. parvum BOCC1和C. andersoni BOCC1扩增产物片段大小分别为830 bp、830 bp和828 bp,经SspⅠ和VspⅠ分别单酶切后形成2种不同的RFLP图谱,根据RFLP图谱可鉴别C. parvum与C. andersoni.序列分析结果显示,C. parvum HCC1与国外牛源C. parvum BOH6、C. parvum GCH1、鹿源C. parvum DR1相应序列同源性均为99.3%;C. parvum BOCC1与国外牛源C. parvum BOH6、C. parvum GCH1、鹿源C. parvum DR1相应序列同源性均为99.5%;C. andersoni BOCC1与国外C. andersoni相应序列同源性为99.9%.系统发育分析结果显示,隐孢子虫虫种形成了2个群,1个群包括C. parvum、C. baileyi、C. meleagridis、C. felis和C. wrairi,另1个群包括C. andersoni、C. muris和C. serpentis. 结论用巢式PCR技术可扩增隐孢子虫基因组DNA中特异片段,根据RFLP图谱可鉴别C. parvum和C. andersoni,表明本实验建立的检测、鉴别C. parvum和C. andersoni的巢式PCR- RFLP方法有效,为我国隐孢子虫分类、隐孢子虫病的分子流行病学研究和诊断打下了良好基础.
