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鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpK的原核重组表达与纯化
目的 通过分子克隆方法制备重组鲍曼不动杆菌外膜蛋白K(OmpK)并进行纯化,为进一步研究该蛋白的免疫活性奠定基础. 方法 采用PCR方法扩增鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC19606外膜蛋白K编码基因,将该基因克隆入原核表达载体pColdI,构建重组质粒pColdI/OmpK.将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导表达重组蛋白,通过镍亲和层析柱进行纯化. 结果 PCR扩增获得大小约726 bp的目的基因片段,将其克隆入原核表达载体pColdI后进行酶切和DNA测序分析,pColdI/OmpK构建正确,重组质粒转化BL21经IPTG诱导后表达目的蛋白(相对分子质量约30×103),经镍亲和纯化得到高纯度的重组OmpK. 结论 通过分子克隆技术使鲍曼不动杆菌OmpK蛋白在构建的原核表达系统中得到高效表达,并获得了高纯度的重组蛋白,为进一步研究鲍曼不动杆菌OmpK的免疫活性奠定了基础.
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基于载体减毒单增李斯特菌的弧菌疫苗菌株构建
目的:利用减毒单增李斯特菌作为疫苗载体的优势,拟构建基于载体减毒单增李斯特菌的弧菌疫苗菌株.方法:使用单增李斯特菌表达载体pERL3过表达弧菌中共同的靶标抗原Ompk;利用PCR和RT-PCR技术分别对过表达菌株鉴定和抗原基因的检测.结果:PCR结果显示成功构建3株Ompk过表达菌株Lm-Ompk(L-O)、Lm-Lmo0576-Ompk(L-L-O)和Lm-P-Ompk(L-P-O);测序结果显示过表达菌株中外源基因的序列与NCBI 结果相似性为100％;RT-PCR结果显示Ompk基因在3株过表达菌株中的转录水平均极为显著(P<0.001);在抗生素条件下,Ompk基因在各过表达菌株中的表达水平显著高于在非抗性条件下的转录水平(P<0.05).结论:成功构建了3株基于载体减毒单增李斯特菌的弧菌疫苗菌株,弧菌中共同的靶标抗原Ompk在3株重组菌株中均可以稳定表达.
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鲍曼不动杆菌OmpK/Omp22融合蛋白的制备及诱导小鼠抗体应答水平检测
目的 制备鲍曼不动杆菌OmpK/Omp22融合蛋白,并检测其抗原特异性抗体应答水平.方法 以鲍曼不动杆菌标准株19606基因组DNA为模板,通过重叠延伸PCR技术获取OmpK/Omp22融合基因片段,将其定向克隆入原核表达质粒pColdI,筛选重组质粒并进行酶切及DNA测序鉴定.重组质粒转化大肠埃希菌BL21株,经IPTG诱导表达,镍亲和纯化柱纯化重组蛋白.小鼠背部皮下注射重组融合蛋白(20 μg/只,体积50 μL)和等体积完全弗氏佐剂,并于初次免疫后第14和21天相同剂量加强免疫1次,分别于末次免疫后7、21 d小鼠内眦取血,测定小鼠血清中抗原特异性抗体滴度.结果 PCR扩增获得约1 400 bp的基因片段,定向克隆筛选到约5 800 bp的重组质粒,纯化的重组融合蛋白相对分子质量约52 000,小鼠血清中检测到特异性IgG抗体,高抗体滴度可达1:102 400.结论 成功制备了鲍曼不动杆菌OmpK/Omp22融合蛋白,小鼠血清中检测到高滴度特异性IgG抗体,为进一步研究其免疫活性奠定了基础.
