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磷酸甘油醛脱氢酶在日本血吸虫感染中的功能研究
目的 研究磷酸甘油醛脱氢酶在日本血吸虫感染中的功能. 方法 荧光定量PCR方法检测磷酸甘油醛脱氢酶在不同来源童虫及日本血吸虫不同发育时期中的转录水平;克隆、表达日本血吸虫磷酸甘油醛脱氢酶,纯化后免疫小鼠,制备免疫血清;采用免疫组织化学法检测磷酸甘油醛脱氢酶在日本血吸虫的组织学定位;于日本血吸虫尾蚴攻击感染前用重组蛋白免疫小鼠,观察其免疫保护效果并探讨其机制. 结果 磷酸甘油醛脱氢酶在不同来源童虫及日本血吸虫不同发育期差异表达,以宿主组童虫和虫卵表达水平较高.磷酸甘油醛脱氢酶主要位于虫体表膜,可能与其免疫保护性效果相关.重组蛋白免疫小鼠减虫率和减卵率分别为47％o和52％. 结论 磷酸甘油醛脱氢酶在日本血吸虫生长发育中具有重要作用,可能与其生殖功能相关.
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荧光定量PCR技术检测乳腺癌CK19 mRNA表达过量的临床应用
目的:探讨荧光定量PCR(FQ-PCR)检测细胞角蛋白19(CK-19)在乳腺癌诊断中的应用.方法:采用FQ-PCR法,并以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内对照测定30例健康女性体检者、30例良性乳腺疾病患者和76例乳腺癌患者的外周血中CK19 mRNA的表达量.结果:正常对照组和良性乳腺疾病组CK19和CK19/GAPDH无显著性差异,乳腺癌组均显著高于前2组,GAPDH在3组间均无显著性差异.若以CK19基因表达量和CK19/GAPDH高于正常对照组±2s为阳性,76例乳腺癌患者的阳性数为41,阳性率53.9%,良性乳腺疾病组阳性数为0.76例乳腺癌中27例患者从手术前到第3次检测,CK19/GAPDH均显下降趋势,但第1次和第2次与手术前比较,无显著性差异,而第3次与手术前比较,CK19/GAPDH均显著低于手术前,存在显著性差异.结论:FQ-PCR技术是高度灵敏、高度特异的快速定量检测CK19基因的方法,可有效监测乳腺癌的诊断、治疗和预后.
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荷载β-actin、GAPDH基因小干扰RNA的双调控增殖腺病毒的构建
目的 构建hTERT启动子调控的表达β-actin、GAPDH基因小干扰RNA(siRNA)的条件增殖腺病毒.方法 分别将β-actin-siRNA、GAPDH-siRNA的模板DNA克隆至质粒pGPH1/GFP/Neo,构建pGPHI/GFP/Neo-β-actin、pGPH1/GFP/Neo-GAPDH.以pGPH1/GFP/Neo-β-actin为模板,PCR扩增出β-actin-siRNA表达框并克隆进质粒pZHTERT,获得pZHTERT-β-actin;以pGPH1/GFP/Neo-GAPDH为模板,扩增出GAPDH表达框并克隆进质粒pZD55,获得pZD55-GAPDH.将pZHTERT-β-actin、pZD55-GAPDH重组,构建穿梭质粒pTD-GAPDH-β-actin,并与腺病毒右臂质粒pBHGE3共转染293细胞,9～12 d后出现病毒空斑,提取重组腺病毒的DNA、聚合酶链反应(PCR)鉴定正确者即为双调控增殖腺病毒TD-GAPDH-β-actin.扩增、纯化、测病毒滴度.结果 成功构建hTERT启动子调控的表达GAPDH、β-actin小干扰RNA的条件增殖腺病毒.病毒滴度为2×10~(11)PFU/ml.结论 成功构建了TD-GAPDH-β-actin,为研究双基因小干扰RNA靶向治疗肿瘤奠定了基础.
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3-磷酸甘油醛脱氢酶活性检测方法的改良及应用
目的 改良3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活性检测方法,并探讨该方法的应用.方法在经典血清GAPDH检测方法基础上,根据该酶的组织分布特点,将血清样本改为全血样本,并对样本及检测条件作了进一步的改良.在方法学研究的基础上,运用改良后的方法分别检测正常鹌鹑、高嘌呤饮食诱导的模型鹌鹑、正常大鼠及高果糖饮食诱导的模型大鼠全血GAPDH的活性.结果 全血与血清GAPDH酶促反应时间曲线类似,变异系数均小于10%.方法 学应用结果显示,与正常鹌鹑比,高嘌呤饮食诱导的模型鹌鹑在高尿酸血症及其合并脂、糖代谢紊乱状态下(60～140 d)全血GAPDH活性显著降低;与正常大鼠比,高果糖饮食诱导的模型大鼠在高三酰甘油血症及其并发尿酸、糖代谢紊乱下(7～28 d),全血GAPDH活性显著降低.结论 改良方法血样容易采集,样品用量少,操作简便、重复性较好,经济实用,易于推广应用.
