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表达H9N2禽流感病毒HA1蛋白的转基因和缓艾美耳球虫的构建
H9N2亚型禽流感病毒已经被证实可以传播到人类，对它存在的潜在危害已受到越来越多的关注。因此，研究安全而有效的H9N2禽流感病毒疫苗已迫在眉睫。为研究和缓艾美耳球虫作为活载体表达及运输禽流感病毒抗原的潜能，本研究构建了可稳定表达H9N2禽流感病毒HA1蛋白的转基因和缓艾美耳球虫。利用黄色荧光蛋白（YFP）及融合的乙胺嘧啶抗性基因（DHFR-TSm2m3）作为报告基因及筛选基因，我们将表达H9N2禽流感病毒HA1抗原的质粒载体核转球虫子孢子，接种鸡后在乙胺嘧啶药物的选择压力下进行筛选并连续传代获得转基因和缓艾美耳球虫系。利用染色体步移和免疫印迹证实了HA1基因的成功插入和表达；利用间接免疫荧光证实HA1蛋白定位于球虫子孢子细胞膜表面和头部。研究进一步发现，转基因球虫的繁殖力与野生球虫相当，感染后亦于第6d达到排卵囊高峰。该转基因和缓艾美耳球虫株具有作为疫苗活载体的潜能。
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2013年广西分离株H9N2亚型禽流感病毒全基因组特性分析
目的 对2013年从广西分离的H9N2亚型禽流感病毒进行全基因测序,并分析其基因组和遗传进化特性,为进一步研究H9N2禽流感病毒的致病机制提供科学依据. 方法 运用RT-PCR方法克隆广西分离株H9N2亚型禽流感病毒8个基因片段,进行全基因测序,对测序结果进行序列比对和遗传进化分析. 结果 序列比对分析表明,H9N2亚型分离株的HA序列裂解位点为RSSR↓ GLF,受体结合位点为YWTNKLY且发生Q226G和G228R双重位点突变,NA耐药相关位点发生3处突变(E119V,R292W和R294G),M2蛋白跨膜区存在S31N变异;编码内部蛋白的6个基因与同年H7N9亚型分离株相似度为90.9％～97.6％.其分子遗传进化关系属于欧亚种系,其中HA基因属于Y280亚系,M基因属于G1亚系,PB2基因属于Korea亚系,PB1、PA、NA、NP和NS属于SH/F/98亚系. 结论 2013年广西分离株是由4种不同H9N2亚型禽流感病毒亚系发生自然重排的产物,属于低致病性禽流感病毒,但对抗流感药物存在一定耐药性,故应加强对禽农场中H9N2病毒流行株变异趋势和传播风险的监测.
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2015-2017年贵州省威宁13株H9N2亚型禽流感病毒HA基因序列分析
目的 了解2015-2017年贵州省威宁H9N2亚型禽流感病毒的分子特征,为禽流感病毒的研究与防控提供依据.方法 对选取的13株病毒进行核酸的提取、血凝素基因(hemagglutinin,HA)的扩增和测序,运用生物信息学软件对H9N2禽流感病毒(AIV) HA基因的同源性、遗传进化、受体结合关键位点、致病相关位点和糖基化位点变异情况进行分析.结果 13株H9N2AIV的HA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为96.1％ ～99.9％和95.7％～100％,均属于DK/HK/Y280/97分支.HA基因与致病性高低相关的裂解位点区域2株为PSRSNR↓GLF,11株为PSRSSR↓GLF,均属于低致病性毒株.与传播感染相关的受体结合位点均发生E198T和Q234L的突变,具有人样受体结合特征.13株毒株HA均含7个与毒力相关的糖基化位点,218位点均存在一个糖基化位点缺失,3 13位点均存在一个糖基化位点的增加.结论 贵州省威宁县H9N2AIVs属于DK/HK/Y280/97系,均为低致病性禽流感病毒,存在人易感位点,病毒一直处于不断的变异之中,故应加强其监测与防控.
