首页 > 文献资料
-
Survivin shRNA对食管癌细胞c-myc、核因子-κB基因表达的影响
目的 探讨Survivin对c-myc、核因子(NF)-κB基因的调控作用.方法 shRNA干扰沉默食管癌ECA109细胞系中Survivin基因表达,观察c-myc、NF-κB基因的表达变化,流式细胞术检测细胞周期的改变.结果 1.食管癌ECA109细胞系中,Survivin shRNA干扰下调Survivin表达后,c-myc mRNA及蛋白的表达水平明显降低;2.Survivin表达后,NF-κB mRNA及NF-κB总蛋白无明显变化,但其蛋白活化表达水平明显降低,NF-κB上游调控核因子κB抑制物激酶(IKK)α、IKKβ mRNA表达下调;3.Survivin表达下调导致G2期延长,G2期细胞比例增加,细胞增殖阻滞.结论 Survivin在转录及蛋白水平对c-myc具有正向调控作用,Survivin表达下调抑制了IKKα、IKKβmRNA的表达及NF-κB的磷酸化.
-
Smac/DIABLO和Survivin shRNA联合转染对大肠癌Lovo细胞凋亡的影响
背景与目的:Smac/DIABLO是一种新发现的促凋亡蛋白,通过阻滞凋亡抑制蛋白(包括Survivin),激活caspase-9和caspase-3而发挥作用.本实验研究线粒体促凋亡蛋白Smac/DIABLO和沉默凋亡抑制基因Survivin联合应用对大肠癌细胞凋亡的影响及其促凋亡机制.方法:构建Survivin的shRNA-EGFP质粒和Smac-pcDNA3.1质粒,将其用脂质体单、共转染至大肠癌Lovo细胞;Western blot检测survivin基因和Smac基因的蛋白表达;Ho-chest 33258染色观察凋亡核形态学变化,并粗略计数凋亡率;流式细胞仪PI单染测凋亡周期;caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性.结果:转染48 h后单、共转染组的Smac蛋白水平增加而Survivin蛋白水平下降;单、共转染组Hochest 33258染色可见明显的凋亡核形态学变化,凋亡率高于各对照组,且共转染组凋亡率(18.5±1.7)%高于单转染组(9.6±1.8)%、(15.0±0.3)%;Smac组G0/G1期增多为(51.0±6.2)%,而Survivin shRNA组S期细胞增多为(53.3±1.3)%(P＜0.05);caspase-3活性比Smac和Survivin shRNA共转组为(169±3)%,高于Smac组(143±5)%、Survivin shRNA组(152±6)%,且都高于各对照组(P＜0.05).结论:Smac/DIABLO和Sur-vivin shRNA协同作用激活caspase-3途径,抑制大肠癌Lovo细胞生长而促进细胞凋亡,Smac阻滞细胞周期于G0/G1期而RNA干扰Survivin后细胞周期阻滞于S期.
-
Survivin shRNA 和 APC 片段双基因的载体构建及其在HT-29细胞的表达
目的：研究表明APC、Survivin 2种基因表达异常在结肠癌的发生发展中具有重要意义。构建Survivin shRNA、APC功能片段双基因共表达慢病毒载体并观察其能否于HT-29结肠癌细胞中成功表达，同时观察其是否能够对结肠癌细胞凋亡产生影响。方法构建3对互补Survivin shRNA 片段，从其中筛选出一条佳干扰shRNA片段，与APC功能片段（ aa1020-1698）相连接构建双基因共表达质粒载体。将HT-29细胞分为实验组、空载组、空白组3组，慢病毒对HT-29进行侵染，观察是否有绿色荧光表达及对转染细胞进行realtime PCR、Western blot 检测 Survivin、APC基因表达水平。通过检测Caspase-3活性来检测细胞凋亡情况。结果①Real time PCR检测后显示对Survivin基因起到佳干扰效果的片段为shR-NA3序列。②构建出的shRNA载体经过送序验证比对后，3对shRNA序列与初设计的序列完全相同。在HT-29细胞中可见绿色荧光，实验组Survivin相对含量（31．71±1．49）较空载组（100±0）、空白组（95．12±2．15）明显减少（P＜0．05），APC mRNA表达水平较空载组（0±0）、空白组（0．51±0．15）明显增加（P＜0．05）。实验组Survivin蛋白相对含量（0．18±0．01）较空白组（0．24±0．04）、空载组（0．22±0．03）明显减少，APC蛋白表达水平（0．147±0．016）较空白组（0．095±0．012）、空载组（0．108±0．015）明显升高（P＜0．05）。③实验组凋亡相对比值（0．573±0．050）较空白组（0．390±0．040）、空载组（0．407±0．030）明显增加（P＜0．05）。结论成功构建Survivin-shRNA-APC双基因共表达慢病毒载体，并能够在HT-29结肠癌细胞中成功表达，该双基因共表达载体可为后续利用该载体进行基因治疗的基础实验提供材料。
关键词： Ht-29 Survivin shRNA APC有效片段 双基因 慢病毒
