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Pkmyt1文献资料
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应用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶Pkmyt1相互作用的候选分子
目的 蛋白激酶Pkmyt1负调控小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂的进程,但具体调控机制还不清楚.因此,利用酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库中筛选与Pkmyt1相互作用的候选蛋白,为研究Pkmyt1调控小鼠受精卵早期发育提供新线索.方法 以小鼠卵巢组织cDNA为模板,构建pGBKT7-Pkmyt1诱饵质粒,转化酵母感受态细胞后,分别接种于SD/-Trp(SDO)、SD/-Trp/X-α-Gal(SDO/X)和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA plates(SDO/X/A)培养板,检测其对酵母的毒性和自身激活能力,Western blotting法检测pGBKT7-Pkmyt1在酵母细胞中的表达.将人卵巢cDNA文库与含有pGBKT7-Pkmyt1的酵母感受态细胞融合,PCR筛选出阳性克隆,提取质粒,测序鉴定,再次检测其对酵母自激活能力,利用生物信息学分析筛选蛋白与胚胎发育的关系.结果 酶切鉴定和Blast分析表明pGBKT7-Pkmyt1质粒构建成功.将该质粒转入Y2H golden中,在SDO板上克隆均匀生长,在SDO/X/A平皿上无克隆生长,Westernblotting检测Pkmyt1在酵母细胞中有表达.PCR验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段.通过初步筛选得到182种能够与Pkmyt1相互作用的蛋白质,经回复性实验进一步验证有46个与Pkmyt1之间存在相互作用的蛋白.结论 通过筛选发现46个蛋白可能通过与Pkmyt1相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育.
