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噬菌体phi29 pRNA载体在RNA干扰中的初步应用研究
RNA干扰是在细胞胞质中双链RNA(dsRNA)介导的序列特异性mRNA的降解[1].这个过程是由21～25个被称为小干扰RNA(siRNA)形成的dsRNA完成[2].目前,这一技术已经广泛应用于研究基因的功能,病毒感染治疗等方面.但是,siRNA在体内容易降解,干扰作用持续的时间不长.新的研究表明枯草杆菌噬菌体phi29有一种稳定的具有载体特性的RNA分子.
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RNA转移载体-pRNA
pRNA(packaging RNA)是枯草杆菌噬菌体ψ29前衣壳上分离出的一种小RNA分子,它作为一种效应分子的天然生物载体,可以保护效应分子不被核酸外切酶降解,防止效应分子在体内的错误折叠.pRNA能够形成二聚体、三聚体和六聚体,因此pRNA不仅可以携带效应分子,而且可以同时携带配体分子,使效应分子具有明确的靶向性.pRNA作为新一代基因转移载体,具有非常强大的应用前景.
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pRNA介导的RNA干扰抑制HBV表达和复制的研究
为了研究由pRNA携带的siRNA(HBVsi18-42)所介导的RNAi过程能有效地抑制HBV的基因表达和病毒复制,我们利用细胞模型和高压注射小鼠模型评价HBVsi18-42对HBV复制和基因表达的抑制作用.通过Western印迹检测细胞内的HBsAg含量,用ELISA检测细胞培养上清和小鼠血清中的HBsAg水平,采用Southern印迹检测HBV的复制中间体,通过免疫组织化学检测肝组织切片中HBcAg的表达情况.试验结果显示,HBVsi18-42能以剂量依赖的方式在293T细胞中抑制HBsAg的表达以及在HepG2细胞中下调病毒HBsAg和HBeAg的表达和病毒复制中间体的水平.在小鼠模型中,注射后的3d内HBVsi18-42使小鼠血清中HBsAg的水平分别下降了98.98%、77.07%和60.73%,免疫组织化学检测显示,在注射后的第3天小鼠肝组织内HBcAg阳性细胞数减少了79.1%.初步结果显示HBVsi18-42无论是在细胞或是在小鼠模型中都能下调HBV的复制和基因的表达.本研究为我们下一步实现由pRNA介导的靶向RNAi及基因治疗提供了理论和技术支持.
