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蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10纯化及生物学功能研究
蒙古黄芪病程相关蛋白(Astragalus membranaceus pathogenesis-related protein 10,AmPR-10)在蒙古黄芪遭遇环境压力和病原体侵袭时大量表达,该研究旨在探讨AmPR-10的生物学功能.蒙古黄芪干燥根经机械粉碎后缓冲液浸提得到蒙古黄芪总蛋白粗提液,总蛋白粗提液经阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱纯化后得到电泳纯AmPR-10.以不同RNA为底物,通过检测260 nm吸光度分析核酸酶活性,结果显示AmPR-10对Yeast tRNA,Yeast RNA,Poly(A)和Poly (C)均表现核酸酶活性,且其佳反应温度为50℃,佳反应pH为7～8,EDTA对其活性无影响,Mg2+对其活性具有激活作用,Co2+,Ca2+和Zn2+对其活性具有抑制作.AmPR-10与已知核酸酶无序列同源性,可能是一种新的核酸酶.采用Lineweaver-Burk双倒数作图法分析AmPR-10木瓜蛋白酶抑制活性,结果显示AmPR-10是木瓜蛋白酶的非竞争性抑制剂.AmPR-10可能通过抑制半胱氨酸酶活性在蒙古黄芪对抗环境压力和抵御病原体侵袭的过程中发挥重要作用.
关键词： 蒙古黄芪病程相关蛋白 核酸酶活性 木瓜蛋白酶抑制剂 -
钩端螺旋体毒性蛋白VapC核酸酶活性及其对宿主细胞毒性作用的研究
目的 了解钩端螺旋体毒素-抗毒素系统中毒性蛋白VapC的功能及其对宿主细胞的毒性作用.方法 以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板,采用PCR扩增全长vapB、vapC、vapBC基因并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rVapB和rVapC 表达情况,Ni-NTA亲和层析柱提纯rVapB和rVapC.检测rVapB和rVapC有无水解问号钩体赖株及THP-1细胞DNA或RNA活性.分别采用实时荧光定量PCR和Western blot试验,检测问号钩体赖株感染THP-1细胞前后vapB和vapC基因转录及表达水平的变化.构建vapB和vapC基因真核表达载体并转染细胞,采用CCK-8试剂检测VapB和VapC蛋白对细胞活性的影响.结果 所克隆的vapB和vapC基因核苷酸及氨基酸序列与文献报道完全相同.所构建的原核表达系统能分别表达rVapB 和rVapC.rVapC可水解RNA,但不水解DNA.问号钩体赖株感染THP-1细胞后,vapB和vapC基因 转录及表达水平均显著上调,部分毒性蛋白VapC外分泌.转染vapC基因的人肾小管上皮细胞HEK293大量死亡.结论 问号钩体赖株VapC蛋白为RNA酶,可在感染宿主细胞过程中外分泌并对细胞有明显毒性.
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蚯蚓体腔液抗病毒活性及其机制的研究
[目的]以赤子爱胜蚓为原料,研究其体腔液的抗病毒活性及可能伪机制,为新型抗病毒药物的开发提供思路.[方法]用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法测定蚯蚓体腔液蛋白酶活性和核酸酶活性;用鸡胚培养检测其抗流感病毒的活性,乙型肝炎病毒表面抗原及e抗原诊断试剂盒检测其对乙型肝炎病毒表面抗原及e抗原的破坏作用.[结果]蚯蚓体腔液具有蛋白酶活性、核酸酶活性每抗病毒活性;各种不同浓度的蚯蚓体腔液对流感病毒的增殖都有显著的抑制作用,且可以抑制乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原表达,呈浓度依赖关系.[结论]蚯蚓体腔液具有抗病毒活性,其可能机制是蛋白酶、核酸酶及各种活性成分单独和/或协同作用的结果.
