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人肝微粒体中氯吡格雷及其代谢产物药物浓度测定方法建立及应用
目的:建立测定人肝微粒体孵育体系中氯吡格雷及其活性代谢产物(AM)和非活性代谢产物(CCAM)药物浓度的检测方法,并将其应用于氯吡格雷的体外代谢研究.方法:AM含有巯基,需用衍生化试剂2-溴-3'-甲氧基苯乙酮(MPB)将肝微粒体孵育体系中的AM衍生化成MP-AM进行测定.分别采用蛋白沉淀法和液液萃取法处理人肝微粒体孵育体系样品,测定氯吡格雷原药及MP-AM和CCAM药物浓度.氯吡格雷原药浓度的测定在HPLC仪上进行,采用Accurasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-水(磷酸调pH 2.85)(22∶ 78),流速1 mL·min-1,检测波长235 nm;MP-AM和CCAM的浓度测定在UPLC-MS/MS仪上进行,采用Thermo C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,5μm),流动相为乙腈(含0.1％甲酸卜水(含0.1％甲酸)(9∶1),流速200 μμL·min-1,正离子模式多反应监测(MRM)扫描分析,离子通道分别为MP-AM m/z503.6→353.8,CCAM m/z 307.7→197.8,内标氯雷他定m/z 382.8→336.9.结果:人肝微粒体孵育体系中氯吡格雷,MP-AM和CCAM线性范围分别为0.5～ 200 μmol·L-1、1～200 ng·mL-1和10 ～2 000 ng ·mL-1,定量下限分别为0.5μmol·L-、1 ng·mL-1和10 ng·mL-1,回收率分别在95.4％～ 98.8％、59.4％～73.4％和54.8％ ～ 72.8％之间,氯吡格雷原药的批内、批间精密度RSD均小于9.4％,MP-AM的批内、批间精密度RSD均小于11.4％,CCAM的批内、批间变异均小于9.7％.内标氯雷他定的回收率分别为96.7％和66.7％.稳定性试验中,在各种贮存条件下氯吡格雷、MP-AM和CCAM均稳定性良好.CCAM生成的酶促反应动力学参数Km值为(15.86±1.83) μmol·L-1,Vmax值为(620.2-19.74) pmol·min-1·mg-1,Clint值为(39.15±2.06)μμL ·min-1·mg-1;AM生成开始随着底物浓度的增加而增加,在底物浓度为20 μmol·L-1时其生成量达到大,随后随着底物浓度的增加其生成量反而降低.结论:所建立的测定方法操作简便快速,重复性好,特异性强,灵敏度高,可用于肝微粒体孵育体系中氯吡格雷及其AM和CCAM药物浓度的测定.
