首页 > 文献资料
-
GPA,GPB分子相关基因GYPA,GYPB外显子全长序列直接测序方法的建立及应用评价
目的 建立人类GPA,GPB分子相关基因GYPA,GYPB外显子全长序列的DNA直接测序方法,并将此方法应用于RBC血型MNS抗原的分析.方法 以整群随机抽样法选择从2011年11月至2012年5月在本中心无偿献血的175例健康成年人的全血样品为研究对象.以血清学方法与序列特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)方法鉴定其MNS血型.根据GenBank提供的NG-007470与NG-007483基因参照序列为依据,自行设计GPA相关基因GYPA全部外显子的7对引物与GPB相关基因GYPB全部外显子的5对引物,探索佳反应体系与PCR扩增条件,且能同时扩增2个基因全长外显子碱基序列,使用ABI3730XL DNA测序仪进行序列分析,以Oli6installer分析软件分析碱基序列.结果 所建立的测序方法可于同一反应体系、相同PCR扩增条件同时检测GPA,GPB相关基因GYPA,GYPB外显子全长序列,并准确分析本组血液样本的MNS血型的特征.基因测序结果与血清学分析及PCR-SSP鉴定结果完全一致.结论 首次建立了稳定、精确、简捷的基因直接测序分型方法,可用于检测MNS血型基因型,并分析GPA,GPB肽链中氨基酸序列的多态性,为MNS血型系统的研究以及人类群体遗传学及分子进化的研究等方面提供广泛的应用价值.
-
用合成肽制备鼠源性抗-GPB单克隆抗体及特性鉴定
目的 用合成肽作为免疫原,制备针对血型糖蛋白GPB的单克隆抗体细胞株.方法 合成人血型糖蛋白GPBs上1段由GPB蛋白第17-36位氨基酸构成的肽段17TKSYISSQTNGETGQLVHRF36,用钥孔虫血蓝(KLH,keyhole limpet hemocyanin)载体蛋白联接的合成多肽免疫BALB/e小鼠.采用杂交瘤技术制备鼠源单克隆抗体,经选择培养和有限稀释亚克隆后,ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,健康小鼠腹腔接种阳性杂交瘤细胞,制备小鼠腹水,谱红 细胞凝集试验、酶处理红细胞、特定稀有血型红细胞凝集试验,以及蛋白免疫印记(Western-Blotting)等技术鉴定抗体特异性;鼠源mAb亚类试剂盒鉴定抗体IgG亚型.结果 ELISA筛选获得阳性单抗细胞株1株,经鼠源mAb亚类试剂盒鉴定,所制备的单克隆抗体属于IgG3,Kappa型轻链.其小鼠腹水制备液与所有谱红细胞在盐水和抗鼠球蛋白介质中均产生凝集(包括Ss,SS,ss,MM,MN,NN表型),与稀有的MkMk细胞不发生凝集.腹水制备液与经木瓜酶、菠萝酶、无花果酶和胰蛋白酶处理的O型红细胞反应,凝集强度与非酶处理红细胞无明显改变.Western-Blotting杂交试验显示小鼠腹水稀释液与红细胞膜蛋白的杂交条带位于GPB的位置.结论 制备1株可分泌抗-GPB mAb的杂交瘤细胞株,为进一步的实验研究奠定了基础.
