首页 > 文献资料
-
酵母双杂交筛选胎肾上腺cDNA文库中HNP-1结合蛋白
[目的]筛选胎肾上腺cDNA文库中与α防御素HNP-1成熟肽具有相互作用的蛋白分子.[方法]通过聚合酶链反应(PCR)成功获得HNP-1成熟肽基因插入酵母表达载体pGBK-T7中构建诱饵质粒,同时提取胎肾上腺RNA,SMART技术制备人胎肾上腺cDNA文库,并采用Matchmaker LexA酵母双杂交系统从胎肾上腺cDNA文库中筛选与HNP-1成熟肽相互作用的蛋白.后通过PCR筛选获得阳性克隆并测序,而后经回转实验,GST pull down以及免疫共沉淀再次验证两者的相互作用关系.[结果]成功构建诱饵质粒pGBKT7-HNP-1以及胎肾上腺cDNA文库并在酵母细胞中正确表达,筛选获得HNP-1成熟肽相互作用的蛋白-melanocortin 2 receptor(ACTH-R),CCAAT-enhancer-binding proteins(C/EBP),Tramembrane trafficking protein(TMP21),low density lipoprotein receptor-related protein 6 (LAP6).终选定促肾上腺皮质激素受体(ACTH-R)作为主要研究对象,且经GST pull down以及免疫共沉淀实验获得了证实两者间具有相互作用的相应的条带.[结论]从胎肾上腺cDNA文库中成功筛选得到α防御素HNP-1成熟肽相互作用蛋白--促肾上腺皮质激素受体.
-
用于酵母双杂交的α-防御素HNP-1成熟肽重组诱饵载体的构建和鉴定
目的:构建和转化人α-防御素HNP-1成熟肽的酵母诱饵重组质粒,为通过酵母双杂交研究其相互作用蛋白分子打下基础.方法:用RT-PCR扩增HNP-1成熟肽基因,将该基因片断与腺病毒载体pBluescript-SK-Ⅱ定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;回收目的片断,将其连接入酵母表达载体pGBKT7,构建重组诱饵表达质粒pGBKT7-HNP-1,测序鉴定.缺陷培养方法检测重组诱饵载体有无毒性和自激活作用.结果序列分析表明HNP-1成熟肽重组诱饵表达质粒构建成功,重组诱饵表达质粒对酵母细胞无毒性作用,无自激活效应发生.结论构建用于酵母双杂交的α-防御素HNP-1成熟肽重组诱饵载体,为找出与人α-防御素HNP-1成熟肽相互作用蛋白分子打下了基础.
