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改良人源杀菌肽LL-37的两种构建及表达方法的对比研究
目的 将改良人源杀菌肽LL-37(rLL-37)用两种方法构建,并分别在原核细胞中融合表达,以寻找较好的制备方法.方法 ①将编码rLL-37基因序列放入载体pET-28a(+),构建表达质粒pET-28a(+)-rLL-37,并于工程菌 BL21(DE3)中融合表达、纯化;②将编码rLL-37基因序列中的部分原核细菌稀有密码子替换为原核细菌偏爱密码子,并在其N端加入一段编码带负电荷的承载蛋白(carrier protein molecule, CPM)基因序列,构建表达质粒pET-30a(+)-CPM-rLL-37,并于工程菌 BL21 Star(DE3)中融合表达、纯化.对比上述2种方法rLL-37的制备率,并初步研究其抗菌性.结果 通过Touch-Down PCR法成功获得rLL-37多肽的DNA序列,质粒pET-28a(+)-rLL-37于杆菌BL21(DE3)中表达,融合蛋白约占全菌蛋白的20%,并成功由强阳离子交换柱芯Macro-Prep High S纯化;设计了一段含28个氨基酸残基的CPM (pHi 2.7、pH 7.4时电荷为-6.0),成功构建表达质粒pET-30a(+)-CPM-rLL-37,并于杆菌BL21 star(DE3)中表达,融合蛋白约占全菌蛋白的35%,并被TALON亲和柱芯有效纯化.经抑菌圈实验证明两种方法所获得的rLL-37多肽对G+、G-菌都具有较好的杀菌力.结论 rLL-37在原核细胞中的高效表达,为深入研究rLL-37的杀菌活性奠定了基础.
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一个承载分子的设计与肽抗生素hPAB-β的高效表达
目的通过设计一个承载蛋白分子高效表达肽抗生素hPAB-β,为大量制备hPAB-β奠定基础.方法根据肽抗生素的特性,确立4条设计原则,并据此设计一489bp的承载蛋白编码序列,用化学合成法获得该序列并将之克隆到pQE-32中构建成表达载体,进一步将肽抗生素hPAB-β基因插入上述表达载体,肽抗生素基因位于承载蛋白编码序列3'-端,两者构成融合基因.将含融合基因的表达载体转化大肠杆菌JM109,筛选阳性重组子,并用阳性重组子表达融合蛋白.结果设计的承载蛋白为163个氨基酸,分子量17668.80, 等电点5.621.用承载分子与肽抗生素hPAB-β构建的融合蛋白表达载体转化细菌后,筛选到4个阳性重组子,均能高效表达肽抗生素融合蛋白,融合蛋白的产量占细菌总蛋白的40%～45%.结论设计的承载蛋白分子能够实现肽抗生素的高效表达.
