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Musculin KO-Foxp3-GFPKI小鼠模型的制备及在严重创伤介导Treg-Th17失衡中的初步应用
目的 制备转录因子Musculin(MSC)敲除(knockout,KO)-叉状头转录因子家族成员3(forkhead box P3,Foxp3)-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)敲入(knockin,KI)小鼠模型,并初步应用于严重创伤介导调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)-Th17失衡研究.方法 通过MSCKO纯合子(homozygote,-/-)小鼠和Foxp3-GFPKI纯合子(homozygote,+/+)小鼠杂交,获取MSCKO(heterozygote,+/-)-Foxp3-GFPKI(+/-)杂合子小鼠,再按同笼兄妹近亲繁殖方法进行杂合子配对,直到获取MSCKO-Foxp3-GFPKI纯合子小鼠.将获得MSCKO-Foxp3-GFPKI小鼠连续交配5代以上,观察各代小鼠的基因型、表现型和遗传稳定性.对获取的MSCKO-Foxp3-GFPKI小鼠和Foxp3-GFPKI小鼠实施失血/骨折,3h后取周围淋巴结(lymph nodes,LN)、肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes,MLN)、肠道集合淋巴结(Peyer's patches,PP)、脾(spleen,SP)、骨髓(bone marrow,BM)和胸腺(thymus,Thy).流式细胞术检测机体免疫器官和组织Treg的分布变化,qPCR检测MSC、Foxp3、孤核受体-γt(orphan nuclear receptor-γt,ROR-γt)的表达水平,进一步验证MSCKO-Foxp3-GFPKI小鼠的实用性,并初步探讨MSC对严重创伤介导Treg-Th17失衡的影响.结果 杂交获得的各代MSCKO-Foxp3-GFPKI纯合子小鼠均能表达各分子标志物,活力、体质量和繁育能力正常.流式细胞术检测结果显示,各免疫器官和组织中均存在不同强度的GFP信号;严重创伤3h后,MSCKO-Foxp3-GFPKI小鼠Treg在LN、MLN、PP和SP中的百分比分别为5.81％、4.81％、1.41％和3.1％,较创伤前差异有统计学意义.qPCR检测结果显示,相对正常组而言,野生型创伤组MSC在外周淋巴器官MLN(6.154 9)和PP(7.789 7)中的相对表达量显著升高(P ＜0.05,P＜O.01);Foxp3在MSCKO创伤组MLN(2.591 2)和PP(1.506 4)中的相对表达量上升(P＜0.01),表明MSC缺失可使创伤后Treg-Th17平衡左移;而ROR-γt在同组MLN (0.5395)和PP(0.544 9)中的相对表达量下降(P＜0.01),同样证实了Treg-Th17平衡发生了偏移.结论 成功制备MSCKO-Foxp3-GFPKI小鼠,遗传性状稳定,分子标志物和表现型明确.严重创伤后MSC可以影响Treg的分布,并使Treg-Th17平衡发生偏移,提示MSC可能作为严重创伤后恢复机体内环境免疫稳态的潜在调节靶点.
关键词： Musculin FOXP3 小鼠模型 严重创伤 Treg-Th17失衡
