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肺炎链球菌三磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH与热休克蛋白DnaJ的相互作用
目的 验证肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,,S.pn)糖酵解关键酶三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和热休克蛋白DnaJ的相互作用.方法 PCR扩增S.pn D39 GAPDH蛋白编码基因gap全长,将其克隆至pET-28a(+),重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导GAPDH-6His的表达,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE鉴定其纯度.重组GAPDH蛋白经腹部皮下免疫昆明小鼠获得多克隆抗体.Western blot鉴定GAPDH的保守性.采用大肠杆菌双杂交系统、直接结合实验、生物膜层干涉技术(Bio-layerInterferometry,BLI)验证GAPDH和DnaJ的相互作用.结果 获得了纯度达90％的GAPDH重组蛋白,并获得了效价达107的抗GAPDH多克隆抗体,Western blot检测显示在7株不同血清型S.pn的全菌裂解液和培养上清中均存在和抗GAPDH抗体反应的特异性条带.大肠杆菌双杂交系统显示GAPDH和DnaJ共转化菌株能够在3-AT平板及双选择培养平板上生长,提示二者在细菌胞内有相互作用.直接结合实验和BLI显示随着加入GAPDH蛋白浓度的增加,二者的结合量也增加,提示GAPDH和DnaJ的结合具有浓度依赖性.BLI实验也显示GAPDH和DnaJ的亲和常数为1.12×10-7 mol/L.结论 糖酵解关键酶GAPDH在肺炎链球菌中保守表达,且为分泌性蛋白;该蛋白和热休克蛋白DnaJ在细胞内存在相互作用,且为直接相互作用.
