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应用DPO引物技术同时检测5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法
目的 应用双启动寡核苷酸引物(Dual Priming Oligonucleotide,DPO)技术建立同时检测日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)、黄热病毒(Yellow Fever Virus,YFV)、西尼罗病毒(West Nile Virus,WNV)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus,SLEV)和登革病毒(Dengue virus,DV)5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法.方法 利用Primer Premier 5.0软件设计5种病毒的特异性DPO引物,对引物浓度、Mg2+浓度和退火温度进行优化,测定多重RT-PCR反应的特异性和敏感性.结果 应用DPO引物技术建立的多重RT-PCR方法可特异性扩增JEV、YFV、WNV、SLEV和DV的142bp、293bp、377bp、630bp和521 bp基因片段,灵敏度分别为5000PFU/ml、4 500 PFU/ml、2.3×105 copies/μl、2.6×104 copies/μl和1.37×104 copies/μl,蚊虫模拟添加实验未发生非特异反应.结论 应用DPO引物技术建立的针对5种蚊媒病毒的多重RT-PCR检测方法有良好的敏感性和特异性,可以同时对JEV、YFV、WNV、SLEV和DV进行检测.
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DPO引物多重RT-PCR技术检测甲型流感病毒的研究
目的 应用DPO引物技术建立一种可以同时检测新甲型流感病毒H1N1、季节性流感病毒H1N1、H3N2以及禽流感病毒H5N1的单管多重RT-PCR检测方法,为流行性感冒的监测与应急诊断提供高通量检测技术.方法 应用DPO引物技术设计针对新甲型流感病毒H1N1、季节性流感病毒H1N1和H3N2以及禽流感病毒H5N1的高特异性DPO引物,并对多重RT-PCR反应体系优化,建立多重RT-PCR检测技术.结果 建立的多重RT-PCR方法可同时扩增新甲型流感病毒H1N1 221 bp、季节性流感病毒H1N1 468 bp和H3N2 592 bp以及禽流感病毒H5N1 350 bp的基因片段.检测敏感性分别为102、102、103和102 copies/ml,并与呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、风疹病毒等呼吸道病毒无交叉反应.结论 本研究建立的多重RT-PCR可以同时准确分型新甲型流感病毒H1N1、季节性流感病毒H1N1和H3N2以及禽流感病毒H5N1,为流行性感冒的监测与应急诊断提供了有效的实验室检测手段.
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基于DPO引物构建的六重PCR检测食品中常见致病菌的方法研究
目的 基于DPO引物在多重PCR检测中的优点,构建一种六重DPO-PCR方法用于检测食品及食源性疾病样本中常见的6种致病菌.方法 以霍乱弧菌的vcc、志贺菌的ipaH、单增李斯特菌的iap、副溶血性弧菌的gyrB、金黄色葡萄球菌的nuc以及沙门菌的ompC为靶基因,设计6对DPO引物,经过反应体系优化,建立了六重DPO-PCR方法.结果 六重PCR反应体系内部DPO引物之间干扰小;扩增后除靶基因外的其他15种细菌DNA无扩增条带出现;对6种致病菌的低检出限分别为:霍乱弧菌,220 cfu/ml;志贺菌,150 cfu/ml;单增李斯特菌,190 cfu/ml;副溶血性弧菌,190 cfu/ml;金黄色葡萄球菌,700 cfu/ml;沙门菌,960 cfu/ml.结论 用DPO引物构建的六重PCR方法具有特异性强,退火温度范围宽,引物之间干扰小,电泳图谱背景清晰,可以达到一管6检的目的,为食品及食源性疾病样本快速准确检测提供了一种新的高通量的快速检测方法.
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基于DPO引物的多重RT-PCR技术检测常见呼吸道病毒
目的:应用DPO引物技术建立一种同时检测流感等5种常见呼吸道病毒的多重RT-PCR检测方法.方法:设计针对流感病毒甲、乙型,呼吸道合胞病毒,腺病毒,以及肠道病毒通用的高特异性DPO引物,通过对多重RT-PCR反应体系的优化,建立上述5种病原体的多重RT-PCR检测技术.结果:建立的多重RT-PCR方法可同时扩增甲型流感病毒等5种病原体的基因片段,检测敏感性分别为102 copies/ml、103 copies/ml、102 copies/ml、103 copies/ml、102 copies/ml,并与副流感等其它呼吸道病毒无交叉反应.结论:本研究建立的多重RT-PCR可以同时准确分型甲、乙型流感病毒,呼吸道合胞病毒,腺病毒和肠道病毒,为呼吸道感染的病原学诊断提供了有效的实验室检测手段.
