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Bak1腺病毒表达载体的构建及对人成骨肉瘤细胞的影响
目的 构建人 Bcl2 拮抗1(Bak1)基因重组表达腺病毒 pAd-Bak1,并感染人成骨肉瘤细胞MG63建立过表达Bak1的细胞模型,检测其对细胞活性的影响.方法 利用qPCR扩增Bak1全长cDNA,利用穿梭质粒pENTER构建载有Bak1基因的重组穿梭质粒pENTER -Bak1,通过基因测序鉴定载体序列.将重组载体PmeⅠ线性化、脱磷酸化后,转入含有腺病毒骨架质粒pAd-Amp的感受态BJ5183细胞中进行基因同源重组.将重组腺病毒质粒pAD-Bak1经PacⅠ酶切线性化后,用Lipofectamine 2000脂质体转染到HEK-293细胞中进行包装扩繁,荧光定量PCR法测定病毒滴度.感染MG63细胞,qPCR和Western blot检测Bak1的表达,MTT检测细胞活性.结果 测序及酶切验证 pENTER-Bak1构建成功. pAD-Bak1 感染MG63 细胞,qPCR检测到细胞中Bak1基因过表达(与NC对照组和空白对照组相比P＜0.01、P＜0.01),Western blot检测到细胞中Bak1蛋白过表达. MTT检测显示与 NC对照组相比,细胞活性减弱(P＜0.05).结论 成功构建了Bak1重组表达腺病毒,验证了其能够感染MG63细胞表达Bak1蛋白,证明了过表达Bak1可以减弱细胞的活性.为进一步研究Bak1的功能奠定了基础.
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Bcl2过表达重组腺病毒的构建及鉴定
目的 构建人B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)过表达载体pENTER-Bcl2,检测其在人成骨肉瘤细胞中的表达及对细胞活性的影响.方法 利用qPCR扩增Bcl2全长cDNA,构建表达载体pENTER-Bcl2,经测序证实后将其转染至人成骨肉瘤细胞(MG63)中,利用qPCR和Western blot方法检测Bcl2的表达,利用MTT检测细胞活性.结果 DNA测序结果显示构建的pENTER-Bcl2载体表达与实验设计相符;Ad-Bcl2组Bcl2 mRNA表达较NC对照组和空白对照组高(P均＜0.01);Ad-Bel2组Bcl2蛋白表达较NC对照组和空白对照组高(P＜0.05,P＜0.01);与NC对照组比较,Ad-Bcl2感染细胞活性增强(P＜0.05).结论 构建的pENTER-Bcl2能在MG63细胞中过表达Bcl2;Ad-Bcl2可以提高细胞的活性,这为研究Bcl-2在骨质疏松发生时的分子生物学机制奠定了基础.
关键词： 过表达人B细胞淋巴瘤-2载体 人成骨肉瘤细胞MG63 构建
