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构建Alb启动子调控HBEGF肝特异性表达的慢病毒载体及其功能验证
目的 构建肝特异性Alb(白蛋白)启动子调控HBEGF(Heparinbinding-epidermal growth factor)表达的慢病毒载体pLV-ATTG.方法 首先以pAlb-Cre-GH/BS为模板,PCR扩增目的基因Alb-enhancer/promoter,In-Fusion克隆至Not Ⅰ酶切的pTRECK6-GFP中,获得pAlbTRECK6(TRECK:toxin receptor-mediated conditional cell knockout);接着以pAlb-TRECK6为模板,PCR扩增Alb-TRECK6,In-Fusion克隆至Xba Ⅰ/BamH Ⅰ酶切的pCD823A-1载体(该载体已卸去EF-1α启动子)中,获得终的慢病毒载体pLV-ATTG,所构建的质粒均经测序和酶切鉴定.然后按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装.包装成功的慢病毒LV-ATTG感染肝癌细胞株BEL-7402细胞,倒置荧光显微镜检测copGFP表达,并收集细胞提取总RNA,以检测HBEGF表达.结果 酶切鉴定和测序证实成功构建了慢病毒载体pLV-ATTG;LV-ATTG感染BEL-7402细胞后,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,同时qRT-PCR检测结果显示HBEGF转基因能够正常表达.结论 成功构建Alb启动子调控HBEGF表达的慢病毒表达载体,为相关后续研究奠定了坚实基础.
