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HeLa细胞ezrin基因基本启动子区转录调控元件的鉴定
目的 鉴定HeLa细胞中调控ezrin基因基本启动子活性的顺式作用元件,探讨ezrin基因在HeLa细胞的表达调控机制.方法 采用碱基定点突变实验和双荧光素酶报告基因分析系统,检测在HeLa细胞中Sp1结合位点(-75/-69,相对于转录起始位点)和AP-1结合位点(-64/-58)对人ezrin基因基本启动子活性的影响;采用电泳迁移率变动分析法(EMSA)实验,检测ezrin基因基本启动子区序列与HeLa细胞核蛋白提取物的特异性结合活性.结果 在HeLa细胞中,单独删除和置换Sp1结合位点或AP-1结合住点,ezrin基因基本启动子活性降低50%左右;同时置换Sp1结合住点和AP-1结合住点,启动子活性几乎完全丧失.ezrin基因基本启动子序列能够与HeLa细胞核蛋白提取物相结合.结论 HeLa细胞中,Sp1结合位点和AP-1结合位点为ezrin基因基本启动子区的重要转录调控元件,有可能存在某种转录因子与之结合,激活ezrin基因转录.
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酵母CYC1启动子TATA框对ERE调控的报告基因的影响
人工合成两条雌激素效应元件(ERE) 重复的核苷酸序列,并在5′和3′端设计Hind Ⅲ and Sph Ⅰ黏性末端.将两条互补的ERE溶液加热至95℃,然后冷却至室温使其形成双股DNA,将双股ERE插入到pERE-CYC-yEGFP载体的细胞色素C(CYC1)启动子相应的酶切位点,生成pERE-CYCα-yEGFP载体.pERE-CYC-yEGFP和pERE-CYCα-yEGFP载体的不同之处是ERE位于CYC1启动子的位置,前者ERE下游的CYC1启动子含有α和β-TATA框,而后只含有α-TATA框.将两者分别转化于可表达人雌激素受体的酵母细胞,构建成两种受雌激素调控的重组酵母细胞.将该重组酵母细胞经6种不同的雌激素化合物作用4 h,发现重组pERE-CYCα-yEGFP的酵母细胞的绿色荧光蛋白(GFP)表达量与受试物间剂量效应关系较差,而含有pERE-CYC-yEGFP载体重组酵母细胞,与受试物具有明显的剂量效应关系.因此,在用于快速、高通量筛选雌激素类化合物生物评价中,其CYC1基本启动子中的α和β-TATA框是必须的.
