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小鼠P2X7受体文献资料
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小鼠P2X7受体基因短发夹RNA慢病毒载体构建与鉴定
目的 应用RNA干扰技术构建小鼠P2X7受体(P2X7R)基因重组慢病毒载体并鉴定.方法 对小鼠P2X7R mRNA分析,设计合成单链引物,经退火后形成双链寡核苷酸序列,放入经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切线性化的pLVX-shRNA-Puro慢病毒质粒载体中,连接构建慢病毒干扰载体pLVX-shRNA-P2X7R.筛选出阳性克隆,进行基因测序鉴定.测序验证正确后,与慢病毒包装辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞,收集病毒上清.经浓缩后感染小鼠RAW264.7细胞,采用流式细胞术评价病毒滴度及感染效率;利用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法鉴定P2X7R shRNA慢病毒的干扰效率.结果 测序证实,成功地构建了重组质粒pLVX-shRNA-P2X7R及小鼠P2X7R基因shRNA慢病毒载体.重组慢病毒的滴度为2×1010TU·L-1,感染效率约为95％.干扰效率约为70％.结论 应用RNA干扰技术可成功构建小鼠P2X7R基因shRNA慢病毒载体.
关键词： 小鼠P2X7受体 RNA干扰 慢病毒载体 RAW264.7细胞
