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高糖对原代培养的视网膜神经节细胞中Toll样受体4表达的上调作用及其意义
背景 研究发现糖尿病性视网膜神经病变的发生早于糖尿病视网膜病变(DR),视网膜神经节细胞(RGCs)的损伤是DR的早期特征性改变.研究表明,Toll样受体4(TLR4)在糖尿病大鼠视网膜中呈高表达,但TLR4与糖尿病性RGCs损伤的关系尚不明确. 目的 研究高糖对原代培养的大鼠RGCs中TLR4表达的影响,为糖尿病性视网膜神经病变的预防和治疗以及靶向药物研究提供依据. 方法采用木瓜蛋白酶消化法从出生后1 ～3d的SPF级大鼠视网膜中分离RGCs并进行纯化培养,采用免疫荧光技术检测RGCs特异性标志物Brn3a的表达以鉴定培养的细胞.将培养的细胞分为正常对照组及10、20、30 mmol/L葡萄糖组,分别于不同浓度葡萄糖培养后24 h及48 h收集细胞,分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法测定RGCs中TLR4 mRNA及其蛋白的相对表达量.结果 细胞接种后贴壁生长并呈近圆形,纯化培养后24 h细胞体积逐渐增大且呈聚集样岛状生长,可见突触和轴突.培养的细胞中Brn3a为阳性表达.葡萄糖培养后24 h岛样细胞群周边细胞轮廓不清,反光弱,葡萄糖培养后48 h部分细胞内结构消失,仅残留细胞轮廓,可见大量细胞碎片.细胞培养后24 h,10、20和30 mmol/L葡萄糖组RGCs中TLR4 mRNA相对表达量分别为0.945±0.237、1.180±0.193和0.827±0.213,培养后48 h分别为1.509±0.422、2.433±0.617和1.435±0.410,均明显高于正常对照组的0.600±0.099和0.724±0.302,差异均有统计学意义(均P＜0.01).细胞培养后24 h,10、20和30 mmol/L葡萄糖组RGCs中TLR4蛋白相对表达量分别为0.442±0.147、0.626±0.128和0.330±0.153,培养后48 h分别为0.464±0.121、0.930±0.441和0.394±0.158,均明显高于正常对照组的0.090±0.050和0.094±0.070,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 高糖环境下大量体外培养的RGCs细胞内结构消失,同时细胞中TLR4表达量上调,提示RGCs中TLR4的过量表达可能与高糖诱导的RGCs损伤有关.
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经房角镜光凝小梁网法建立慢性高眼压大鼠模型及其与经角膜缘光凝法的比较
背景 慢性高眼压动物模型的建立是青光眼发病机制研究的基础,以往激光光凝建立慢性高眼压动物模型的方法存在模型眼压波动大,需要重复光凝和并发症多的问题,造模方法的改良对于顺利开展相关的实验研究具有重要意义. 目的 用经房角镜光凝小梁网法建立大鼠慢性高眼模型,并与以往的经角膜缘光凝法进行比较. 方法 选取8 ～12周龄清洁级Fischer344大鼠36只,将动物分为正常对照组、经角膜缘光凝组和经房角镜光凝组,每组12只,经角膜缘光凝组采用532 nm YAG激光经角膜缘光凝大鼠右眼小梁网建立慢性高眼压模型,激光能量为440 ～ 500 mW,激射光斑40 ～ 60个;经房角镜光凝组激光能量为800 ～850 mW,激射光斑100～120个.光凝后用Tonolab眼压计测量并观察各组大鼠眼压变化;于光凝后第3周每组处死5只大鼠,分离视网膜,采用免疫荧光技术检测并比较各组大鼠视网膜中Tuj-1阳性的视网膜神经节细胞(RGCs)数目.实验动物的使用及喂养遵循ARVO声明.结果 造模后3周各组大鼠一般情况可,眼表无明显损伤.经角膜缘光凝组和房角镜光凝组慢性高眼压模型的成模率分别为75％和100％.正常对照组、经角膜缘光凝组和经房角镜光凝组大鼠模型眼造模后3周的平均眼压分别为(11.0±1.3)、(23.4±12.6)和(25.3±4.9)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),峰眼压分别为(12.3±1.0)、(50.5±7.3)和(44.3±12.3)mmHg,组间总体比较差异均有统计学意义(F=25.496、80.762,均P＜0.001),其中经角膜缘光凝组和经房角镜光凝组大鼠模型眼平均眼压均明显高于正常对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.001),而2个组间平均眼压和峰眼压差异均无统计学意义(P=1.000、0.195).正常对照组、经角膜缘光凝组和经房角镜光凝组大鼠视网膜中Tuj-1阳性RGCs数目分别为(2 048.2±148.5)、(645.2±177.1)及(1 223.7±148.6)/mm2,总体比较差异有统计学意义(F=98.767,P＜0.001),其中经角膜缘光凝组和经房角镜光凝组大鼠视网膜中Tuj-1阳性RGCs数目均明显少于正常对照组,且经角膜缘光凝组大鼠视网膜中Tuj-1阳性RGCs数目明显少于经房角镜光凝组,差异均有统计学意义(均P＜0.01). 结论 经房角镜光凝小梁网能够诱导大鼠慢性高眼压并导致RGCs损害,但眼压升高模式及RGCs损害程度与经角膜缘光凝法有所不同,经房角镜光凝法建立慢性高眼压模型成模率更高.
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两种常用大鼠视神经钳夹伤模型造模效果的比较
背景 视神经钳夹伤(ONC)动物模型是外伤性视神经损伤致病机制及治疗方法相关基础研究的主要工具,目前常用的造模方法有经眼眶上缘开神经鞘膜视神经钳夹法和经球结膜外眦部夹伤视神经法,但关于2种模型优劣评价的研究很少. 目的 比较2种常用大鼠ONC模型的造模效果,为相关的实验研究中造模方法的选择提供依据.方法 采用随机分配方法将8～10周龄健康成年雄性SD大鼠24只分为经眶上缘开神经鞘膜ONC组和经眶上缘开神经鞘膜ONC 20 s、40 s、60 s组,分别采用经眶上缘开神经鞘膜视神经夹伤法(20 s)及经球结膜外眦部夹伤视神经法在大鼠的一侧眼建立ONC动物模型,各组大鼠的正常对侧眼作为对照.于造模后14 d记录各组大鼠闪光视觉诱发电位(F-VEP)P1波;制备大鼠视神经组织切片,采用苏木精-伊红染色法观察大鼠视神经的组织病理学改变;采用免疫荧光法观察并计数大鼠视网膜组织中Brn-3α阳性视网膜神经节细胞(RGCs).对2种造模方法的造模过程和检测结果进行比较.结果 造模后14d,经眶上缘开神经鞘ONC组和经球结膜ONC 20 s组、40 s组、60 s组大鼠的F-VEP P1波潜伏期较各自的正常对侧眼均明显延长,差异均有统计学意义(t=-11.64、-8.04、-6.50、-10.84,均P＜0.01);经眶上缘开神经鞘ONC组大鼠P1波潜伏期与经球结膜ONC 20 s、40 s、60 s组大鼠比较均明显延长,差异均有统计学意义(P=0.01、0.02、0.05);各组大鼠术眼P1波振幅与其正常对侧眼比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).造模后14 d,免疫荧光检测显示各组大鼠模型眼视网膜上Brn-3α表达阳性RGCs数均较正常对侧眼明显减少,经眶上缘开神经鞘ONC组大鼠视网膜上Brn-3α表达阳性RGCs数为(13.60±2.14)个/视野,为其正常对侧眼的47.49％,经球结膜ONC 20 s、40 s和60 s组中Brn-3α阳性RGCs数分别为(18.74±3.61)、(15.84±2.31)和(14.58±3.23)个/视野,分别为其正常对侧眼的67.70％、56.69％和50.17％,经眶上缘开神经鞘ONC组大鼠视网膜中Brn-3α阳性RGCs数与经球结膜ONC 40 s和60 s组比较,差异均无统计学意义(均P＞0.05).组织病理学检查显示,各组大鼠造模眼神经胶质细胞核排列紊乱,细胞基质空泡化,可见大量炎性细胞浸润,以眶上缘开神经鞘ONC组更为严重.结论 与经球结膜ONC模型鼠比较,经眶上缘开视神经鞘ONC模型大鼠视神经形态结构损害更为严重,视神经的传导功能更为迟缓,RGCs的存活率更低.
关键词： 视神经/损伤 视神经/病理学 闪光视觉诱发电位 视网膜神经节细胞/病理 动物模型
