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pGenesil-2.1-iASPP-shRNA质粒的构建及转染
目的 构建针对iASPP基因的短发卡RNA干扰(iASPP-shRNA)质粒,并转染胃癌细胞AGS(p53野生型).方法 以iASPP为靶基因设计两条带有短发卡结构的寡核苷酸序列,连接到pGenesil-2.1载体,转化感受态大肠杆菌DH5a,提取质粒转染胃癌细胞并培养形成稳定的细胞系,PCR检测转染AGS细胞中的iASPP基因.结果 构建的pGenesil-2.1-iASPP-shRNA质粒测序证实iASPP基因序列完全正确,该质粒转染AGS细胞后,其iASPP基因表达受抑制.结论 成功构建了pGenesil-2.1-iASPP-shRNA质粒,并可成功转染AGS细胞而抑制其iASPP基因的表达.
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特异性siRNA抑制宫颈癌细胞中iASPP基因的表达研究
目的 研究RNAi 技术抑制宫颈癌细胞HeLa中iASPP基因的表达.方法 构建真核细胞表达特异性shRNA的pGENESIL-1/iASPP重组质粒,脂质体转染HeLa细胞后用半定量RT-PCR和western blotting技术分别检测RNAi前后HeLa细胞中iASPPmRNA和蛋白水平的变化;利用细胞计数和细胞克隆形成实验检测HeLa/PS-iASPP细胞的增殖能力,后DNA ladder实验测定细胞凋亡.结果成功构建了pGENESIL-1/iASPP重组质粒;在RNAi 24,48,72 h后HeLa细胞中iASPP mRNA分别下降了25.50%,85.60%和90.80%,iASPP蛋白水平显著下降;RNAi后细胞计数明显降低,细胞克隆形成抑制率为76.1%;RNA干扰后HeLa细胞DNA分子产生断裂并发生了凋亡的特征性改变.结论 应用RNA干扰技术能有效地、特异地抑制宫颈癌细胞中iASPP基因的表达,iASPP基因可能成为治疗宫颈癌潜在的分子靶点.
