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弓形虫ROP16Ⅰ/ⅢDNA疫苗不能诱导小鼠有效的保护性免疫
目的 利用ROP16Ⅰ/Ⅲ基因真核表达重组质粒免疫BALB/c雌性小鼠,检测小鼠体液免疫和细胞免疫,评估ROP16Ⅰ/nⅢ作为潜在的分子疫苗的价值.方法 克隆Chinese 1型弓形虫ROP16Ⅰ/Ⅲ,将其插入真核表达载体pEGFP-C2中构建重组质粒pEGFP-ROP16Ⅰ/Ⅲ,脂质体法转染T293细胞并观察体外表达.Western blotting分析鉴定.将36只SPF级小鼠随机均分为:①PBS组;②空质粒组;③pEGFP-ROP 16 Ⅰ/Ⅲ组.每2周肌注免疫1次(100 μg/只),共3次;于免疫前及每次肌注前1d和末次免疫后2周收集小鼠血清,间接ELISA法检测血清抗弓形虫IgG.于末次免疫2周后取小鼠脾脏,分离淋巴细胞培养测细胞因子.剩余小鼠腹腔注射Chinese 1型弓形虫Wh3株速殖子1 000个/只,观察小鼠攻击感染后的存活时间和存活率.结果 真核表达载体构建成功,体外见到重组质粒pEGFP-ROP 16Ⅰ/Ⅲ在T293细胞的表达;pEGFP-ROP 16 Ⅰ/Ⅲ末次免疫后血清中IgG水平及脾淋巴细胞细胞因子均无明显升高(P＞0.05);攻击感染后,免疫组小鼠比对照组的存活时间无延长(P＞0.05);生物信息学分析发现ROP16Ⅰ/Ⅲ缺乏线性B细胞表位.结论 Chinesel型弓形虫的ROP16Ⅰ/Ⅲ由于其分泌的定位和结构特点,不能诱导小鼠产生有效的抗Wh3株攻击感染的免疫保护.
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基于CRISPRR/Cas9技术的弓形虫rop16Ⅰ/Ⅲ缺陷虫株的构建及毒力鉴定
目的 构建并鉴定弓形虫RH株rop16Ⅰ/Ⅲ缺陷虫株.方法 利用CRISPR-Cas9技术进行构建基因缺陷虫株.运用E-CRISPR数据库设计gRNA,并使用定点突变试剂盒突变pSAG1∷Cas9-U6∷sgUPRT质粒上的gRNA,构建pSAG1∷Cas9-U6∷sgrop16质粒.此外将rop16上游序列、乙胺嘧啶抗性基因、rop16下游序列3个片段连接成donorDNA,克隆于pUC19质粒上,PCR扩增donor DNA片段.pSAG1∷Cas9-U6∷sgrop16质粒和donor DNA片段电穿孔转染弓形虫,电转后悬液接种于HFF-1细胞中,3μmol/L乙胺嘧啶筛选电转后的虫株.PCR和Western blotting鉴定克隆化筛选虫株.吉姆萨染色分别比较RH株和RH△rop16株对HFF-1细胞的增殖与入侵.并比较RH株和RH△roop16株分别感染昆明小鼠后小鼠的生存和死亡率.结果 经测序比对,成功构建了pSAG1∷Cas9-U6∷sgrop16质粒和pUC19-donorDNA质粒.PCR鉴定结果显示,DHFR编码(编码乙胺嘧啶抗性基因)序列成功插入至靶点位置,Western blotting分析结果未见RH△rop16株有Rop16Ⅰ/Ⅲ蛋白表达.吉姆萨染色后计数结果表明,RH株感染的细胞内每个纳虫泡内速殖子的平均数显著高于RH△rop16虫株.毒力试验结果显示,RH株感染的小鼠在第7d即出现死亡,而rop16Ⅰ/Ⅲ缺陷株在第9d出现死亡,但两种弓形虫株感染动物在第10 d均全部死亡,两组间无统计学差异.结论 利用CRISPR-Cas9技术成功构建了rop16Ⅰ/Ⅲ缺陷的弓形虫RH虫株,rop16Ⅰ/Ⅲ基因敲除对弓形虫RH株毒力无明显影响.
关键词： 刚地弓形虫 ROP16Ⅰ/Ⅲ CRISPR/Cas9 RH株 基因缺陷
