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TNF-α3′-UTR双荧光素酶报告基因系统的构建及丹参酮类药物筛选
目的：构建并鉴定pGL3-TNF-α3′端非翻译区( UTR)双荧光素酶报告基因( DLR)表达系统,以此基于调控TNF-α转录后水平对丹参酮类成分进行筛选。方法反转录人脐静脉内皮细胞HUVEC的mRNA成cDNA,以之为模板,PCR扩增含TNF-α3′-UTR的DNA片段全长,经酶切后连接至荧光素酶报告载体pGL3-control上,构建出pGL3-TNF-α3′UTR全长的荧光素酶报告基因载体并进行鉴定。将所构建的pGL3-TNF-α3′UTR与pSVRenilla质粒组成双荧光素酶报告系统共转染至单核巨噬细胞RAW264.7,经脂多糖诱导后利用该双荧光素酶报告基因表达系统判定丹参酮类成分对TNF-α转录后调控是否有影响。结果成功构建 pGL3-TNF-α3′UTR荧光素酶报告基因,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致。脂多糖( LPS )可以明显诱导转入pGL3-TNF-α3′UTR载体细胞的荧光强度。丹参酮类成分中隐丹参酮可以明显降低LPS诱导的pGL3-TNF-α3′UTR载体细胞的荧光素酶活性。结论成功构建含TNF-α3′UTR区的双荧光素酶报告基因表达系统,并以此从丹参酮类化合物中筛选出隐丹参酮,可以对TNF-α的转录后水平进行抑制调控。
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丙型肝炎病毒3'非编码区准种研究
目的获得中国大陆1b型丙型肝炎病毒(HCV)3′非编码区 (3′UTR)全长序列,探讨在丙型肝炎病毒3′非编码区(高变区)是否存在复杂的准种特性.方法利用逆转录套式聚合酶链反应(RT-PCR)限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)初步筛选出6例1b型HCV感染者,采用半套式RT-PCR法扩增出约400 bp的cDNA片段,每例选择12～15个克隆测序.结果每例获得了5～8株全长1b型HCV3′非编码区克隆,由高变区,Poly(u)区,Poly(u/c)区及98碱基区四部分组成;各克隆中序列变异位点主要分布于高变区,Poly(u/c)区,核苷酸同源性0.2%～2.1%,呈现明显的准种分布特征.结论在丙型肝炎病毒3′非编码区(高变区)存在复杂的准种特性.
