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Neuritin基因高表达系统构建及转染大鼠雪旺细胞的鉴定
目的 构建neuritin基因的高表达系统,观察其转染雪旺细胞后neuritin的表达.方法 根据大鼠neuritin mRNA序列体外合成编码序列(CDS区),构建到pGH载体,与酶切后的GV208-绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体片段进行连接、转化、酶切及测序鉴定重组克隆.提取阳性克隆,转染入293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞.将雪旺细胞分为三组:空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)、高表达组(C组).实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测细胞neuritin的表达.结果 大鼠neuritin正确插入慢病毒载体,C组neuritin mRNA水平显著高于A组、B组(P＜0.01).检测到neuritin蛋白与GFP的融合蛋白.结论 成功构建neuritin慢病毒高表达系统；其转染的雪旺细胞neuritin表达升高.
关键词： Neuritin基因 慢病毒高表达系统 雪旺细胞 -
大鼠雪旺细胞Neuritin基因shRNA表达载体构建及其体外抑制效应
目的 构建针对大鼠neuritin基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)表达载体,并研究该载体对neuritin基因表达的沉默效应及雪旺细胞生存的影响.方法 设计并合成neuritin靶向siRNA序列,连接pGCSIL-GFP慢病毒表达载体后,将neuritin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染人293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞,分为空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)和干扰组(C组).RT-qPCR、Western blot及Annexin V/PI方法分别检测细胞neuritinmRNA、蛋白表达及细胞凋亡情况.结果 与A、B组相比,C组雪旺细胞neuritin mRNA和蛋白表达水平降低,而细胞凋亡明显增加(P＜0.01或P＜0.05).结论 成功构建neuritin基因shRNA慢病毒表达载体.其转染的雪旺细胞neuritin基因表达受抑制,并导致细胞凋亡增加.
关键词： Neuritin基因 shRNA载体 慢病毒转染 雪旺细胞 凋亡 -
Neuritin基因在单眼剥夺成年大鼠视皮层中的表达
目的 研究单眼剥夺(MD)视皮层neuritin mRNA的表达.方法 35只Wistar大鼠分为正常对照组、MD组和反缝合(RS)组,缝合14日龄大鼠右眼睑建立MD模型,RS组大鼠缝合单眼至90日龄时进行反缝合,并持续暴露于灯光中6、12、24、48 h和1周,其余2组大鼠至90日龄时直接取左侧大脑视皮层,采用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测所有大鼠视皮层neuritin mRNA的表达情况.结果 不同组大鼠视皮层中neuritin mRNA表达量的总体差异有统计学意义(F=19.235,P＜0.05).MD组大鼠视皮层中neuritin mRNA的表达量低于正常对照组,差异有统计学意义(t=-0.097,P＜0.05);RS 6h组大鼠视皮层中neuritin mRNA的表达量明显高于MD组,差异有统计学意义(t=-0.028,P＜0.05).RS12、24、48h组大鼠视皮层中neuritin mRNA的表达量明显高于MD组,差异均有统计学意义(t=-0.046,t=-0.064,t=-0.065;P＜0.05).Neuritin mRNA的表达在实验24h达到高峰,然后逐渐下降,但RS1周组与MD组neuritin mRNA的表达比较,差异有统计学意义(t=-0.037,P＜0.05).结论 Neuritin mRNA在MD成年大鼠和RS不同时间大鼠视皮质表达呈动态变化,提示年龄超过视觉发育敏感期的MD成年大鼠的视皮层仍具有一定程度的可塑性.
关键词： Neuritin基因 视皮质可塑性 单眼形觉剥夺 视觉发育 -
骨髓特异性高表达neuritin转基因小鼠的构建
目的 构建骨髓特异性高表达neuritin转基因小鼠并进行繁殖、基因型鉴定,为进一步研究neuritin蛋白治疗外周神经病变奠定基础.方法 将2对转基因小鼠loxp-stop-loxp-neuritin与转基因小鼠lyz-Cre/+进行饲养和繁殖,对其子鼠提取尾组织DNA,采用PCR方法鉴定小鼠基因型,获取基因型neuritin loxp/+_lyz-Cre/+即为骨髓特异性高表达neuritin小鼠.选择C57BL/6j野生型小鼠作为对照,并通过组织免疫荧光检测小鼠骨髓neuritin的表达量,进一步验证neuritin loxp/+_lyz-Cre/+小鼠的准确性.结果 2种转基因纯合子小鼠均有繁殖能力,相互杂交其子鼠基因型为neuritin loxp/+_lyz-Cre/+、neuritin loxp/-_lyz-Cre/+、neuritin loxp/+_lyz-Cre/-、neuritin loxp/-_lyz-Cre/-,其繁殖结果基本符合孟德尔遗传定律.免疫荧光结果显示:neuritin loxp/+_lyz-Cre/+小鼠骨髓neuritin表达量显著高于野生型小鼠(P<0.05).结论 PCR是小鼠基因型鉴定的可靠方法.雄性lyz-Cre/+小鼠与雌性neuritin loxp/+小鼠交配是获得neuritin loxp/+_lyz-Cre/+小鼠的有效途径.
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Neuritin过表达对BMSCs增殖的影响
目的:为全面了解Neuritin的功能,探讨Neuritin对细胞增殖的影响.方法:利用已构建Neuritin真核表达载体pcDNA3.1(-)A- Neuritin,转染BMSCs,通过MTT、细胞计数等观察Neuritin过表达对BMSCs增殖的影响.结果:MTT检测结果显示,BMSCsneu约在第3天进入对数生长期,第5天进入平台期；细胞计数结果显示,Neuritin过表达与BMSCs的数目呈负相关,并且在各检测点上,稳定表达Neuritin的BMSCs数目均低于对照组.结论:Neuritin过表达抑制了BMSCs的增殖.
关键词： pcDNA3.1(-)A Neuritin基因 细胞增殖
