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离子交换法分离纯化酶反应液中5-氟尿苷的研究
为开发从酶反应液中分离纯化5-氟尿苷的方法,研究了利用阴离子交换树脂以及硅胶柱色谱实现转化产物分离纯化的工艺；实验采用HPLC为检测方法,以5-氟尿苷含量为考察指标,从吸附量,洗脱率,回收率的角度考察了各种条件的影响.终确定以D301树脂为吸附剂；佳吸附条件为动态吸附,温度25℃,pH 8；动态洗脱,洗脱剂5％ NaCl溶液,体积流量为3BV/h;再利用硅胶柱色谱,采用200～300目硅胶,以正己烷∶乙酸乙酯=12∶88作为洗脱剂,洗脱后结晶可得到5-氟尿苷纯品,色谱纯,终收率72.4％.
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利用嘧啶核苷磷酸化酶基因工程菌酶法合成5-氟尿苷的转化率影响因素的研究
研究酶法合成5-氟尿苷(5-FUR)的反应条件.利用嘧啶核苷磷酸化酶(Pyrimidine-nudeoside phosphorylase,PyPNase)基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a+合成5-氟尿苷(5-FUR),考察不同反应条件对转化率的影响;尝试不同反应体系对转化率的影响.结果:(1)佳转化条件:菌体:0.5 WCG/L;UR:10 mmol/L;5-FU:45mmol/L;PBS:40 mmol/L;T:50℃;pH 7.4;t:60 min,转化率可达91.27%;(2)以Na2SO4溶液为溶剂,比以PBS溶液为溶剂的转化率略有提高.微生物酶法合成5-氟尿苷(5-FUR)的转化率较高,可考虑用于工业生产.
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产气肠杆菌EAM-Z1荚膜的去除对胞内pyNPase活力和菌体生长量的影响
研究产气肠杆菌(EAM-Z1)荚膜去除或变薄对于胞内嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)活力的菌体生长量和影响.在培养基中增加碳源以去除荚膜或使荚膜变薄,研究其对菌体生长的影响,并通过转化合成5-氟尿苷的方法研究其对PyNPase活力的影响.结果:在培养基中增加4%的D-甘露糖,1%的甲醇,2%的甘油或2%的丙酮都能使产气肠杆菌的荚膜变薄;其中增加2%丙酮时,菌体量增加43.92%,在工业生产中有重要意义,转化率为57.5%,提高2.8%,PyNPase比活力提高4.8%,转化合成5-氟尿苷的佳反应时间为45min,缩短了1/4.
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利用产气肠杆菌EAM-Z1转化合成5-氟尿苷的转化率影响因素的研究
利用产气肠杆菌EAM-Z1转化合成5氟尿苷,从筛选中间体稳定剂、底物流加、底物诱导、菌体冻融和石英砂研磨等方面研究转化率的影响因素,结果:(1)转化过程中加入40mmol/L的硼砂可以将转化率达到75.56%,提高30.28%;加入10mmol/L的甘氨酸可以使转化率达到61.92%,提高6.76%;(2)流加5-氟尿嘧啶可以将转化率提高到87.78%;(3)培养过程中加入尿苷诱导效果并不明显,尿苷浓度为0.001 g/L时效果佳,提高3.63%;(4)菌体冻融和石英砂研磨使转化率下降26%.
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酶法合成5-氟尿苷
采用产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes) CPU 7856变异株的游离细胞,利用其中的嘧啶核苷磷酸化酶(Uridine Phosphorylase)通过碱基交换进行酶法合成目的物.试验以30mmol/L尿苷(UR),30mmol/L 5-氟尿嘧啶( FU),30mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.8)的混合物加入10%的产气肠杆菌湿菌体反应3h,底物UR的转化率可达50%.
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5-氟尿苷生物转化率的影响因素研究
目的:利用产气肠杆菌EAM-Z1转化合成5-氟尿苷(5-FUR),并对影响5-FUR转化率的因素进行了考察.方法:以磷酸盐缓冲液(PBS)为溶剂的5-FUR的转化率为对照,考察反应溶剂Na2SO4溶液、中间体稳定剂、金属离子、固定化细胞、粗酶液等因素对转化率的影响.结果:以Na2SO4溶液为溶剂进行转化,转化率可提高10%左右;双中间体稳定剂硼砂+硼酸使转化率提高20%左右;Mg2+和Zn2+可提高产物的转化率,在以PBS为溶剂的转化反应中,1 mmol/L Mg2使转化率提高了11.31%,以Na2SO4溶液为溶剂的转化反应中,4 mmol/L Zn2+使转化率提高了9.43%;以固定化细胞进行生物转化,反应时间缩短为1 h,但转化率略有降低;以粗酶液进行生物转化,反应时间为4 h,转化率提高21.29%.结论:5-FUR的转化率受多种因素的影响,合理的反应溶剂如Na2SO4溶液、中间体稳定剂、金属离子、提取酶粗提液等方法均可以较显著的提高5-FUR的转化率.
