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达托霉素产生菌玫瑰孢链霉菌NRRL11379接合转移系统的建立与优化
玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)NRRL11379是一种具有环脂肽结构抗生素-达托霉素(Dapto-mycin)的产生菌.建立高效稳定的遗传操作系统是研究该链霉菌各功能基因作用以及构建基因工程菌的基础.实验探索了通过电穿孔、接合转移向玫瑰孢链霉菌中转入外源DNA的可能性.以链霉菌(Streptomyces)噬菌体ΦC31所构建的整合型载体pSET152-dptP为出发质粒,玫瑰孢链霉菌NRRL11379新鲜菌丝体作为受体菌,在不同的电场强度下进行电穿孔实验,结果表明:以玫瑰孢链霉菌NRRL1 1379新鲜菌丝体为受体菌,未获得转化子.以ET12567(PUZ8002,pSET152-dptP)为供体,玫瑰孢链霉菌NRRL11379新鲜菌丝体为受体,选取MS培养基为接合转移培养基,利用属间接合转移将质粒pSET152-dptP转入菌株NRRL11379中.结果表明:当供体大肠杆菌ET12567细胞量和玫瑰孢链霉菌NRRL11379菌丝体量比例为1∶1,MS培养基中MgCl2的浓度为0.01 mol/L,培养20 h后覆盖阿泊拉霉素50 μg/mL以及萘啶酮酸50 μg/mL时,接合转移频率高,可达1.75×10-4.通过PCR验证,质粒pSET152-dptP已整合至玫瑰孢链霉菌NRRL11379菌株的染色体上.确定了玫瑰孢链霉菌属间接合转移的佳条件.
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透明颤菌血红蛋白基因在弗氏链霉菌中的表达及其对菌体生长和泰乐星合成的影响
质粒pIJ4026和pRK404-vhb分别含有红霉素抗性基因启动子(PermE)和透明颤菌血红蛋白基因(vhb),先用PCR分别扩增二者,再用SOE-PCR(Splicing by overlap extension PCR)将不含自身启动子的vhb基因置于PermE之下;将SOE-PCR产物克隆到链霉菌整合性载体pSET152上,构建成vhb基因表达载体pWQ2004.通过大肠埃希氏菌-链霉菌属间接合转移的方式将pWQ2004导入弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)中,利用pWQ2004上ФC31整合性位点使vhb基因整合到弗氏链霉菌染色体上.PCR验证表明,vhb基因已整合到染色体上,CO结合差光谱分析则表明vhb基因在弗氏链霉菌中成功表达.摇瓶与上罐发酵显示vhb基因的表达可明显促进菌体生长与泰乐星的生物合成.
