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银屑病患者外周血单一核细胞CTLA4表达及基因多态性分析
目的了解银屑病患者外周血单一核细胞(PBMC)细胞毒T细胞分子4(CTLA4)表达状况及基因多态性.方法选择临床和/或病理诊断明确的银屑病患者33例作为CTLA4 mRNA和蛋白表达研究对象,另选133例患者作为CTLA4基因多态性分析对象,并以正常人作平行对照.分别用原位杂交、免疫组化、PCR等方法检测CTLA4 mRNA、蛋白表达、第一外显子和3'末端非翻译区(AT)n重复序列,对PCR扩增产物进行单链构象多态性、限制性片段长度多态性及基因序列分析.结果与正常人组相比,银屑病患者PBMC经金黄色葡萄球菌肠毒素B刺激后CTLA4 mRNA、蛋白表达强度显著减弱,且无一定规律;分析发现,CTLA4第一外显子第49位点G和3'末端非翻译区106 bp等位基因与银屑病发生存在显著关联.结论银屑病患者CTLA4基因转录和表达存在缺陷,且这一缺陷与CTLA4基因多态性存在关联,提示CTLA4基因可能是导致银屑病自身免疫反应发生的侯选基因之一.
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CTLA4Ig诱导银屑病Th1/Th2转换的体外研究
目的研究银屑病的Th1/Th2反应模式,并观察CTLA4Ig在诱导银屑病Th1/Th2转换中的作用.方法标本取自33例寻常型银屑病患者和20例正常人对照,利用植物血凝素(PHA)和葡萄球菌肠毒素B(SEB)单独及与CTLA4Ig协同刺激外周血单一核细胞(PBMC)增殖,通过酶联免疫吸附法检测PBMC培养上清液中白介素2(IL-2)、干扰素γ(IFN-γ)和白介素4(IL-4)水平.结果SEB显著促进银屑病组3种细胞因子的分泌(P<0.01);进行期IFN-γ/IL-4的比值明显高于静止期(P<0.01).CTLA4Ig可以抑制IL-2、IFN-γ的分泌,并呈剂量依赖关系;而IL-4相对于IL-2及IFN-γ分泌是增强的;当CTLA4Ig浓度达到10μg/mL时,3种细胞因子的分泌均明显被抑制.结论银屑病属于Th1型反应模式,CTLA4Ig可以下调Th1型细胞因子,上调Th2型细胞因子,提示CTLA4Ig具有诱导银屑病的Th1/Th2失衡向Th2转换的作用.
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TNF受体(P55)胞外区和IgGFc嵌合蛋白高效原核表达载体的构建
目的构建TNF受体(P55)胞外区和IgGFc嵌合蛋白的高效原核表达载体. 方法以人心肌cDNA文库为模板,PCR扩增TNF受体(P55)胞外区全基因(sTNFR-ED),亚克隆入pGEM-T/IgGFc中构建pGEM-T/sTNFR-ED∶IgGFc重组子,然后以其为模板,在上游引物中引入原核细胞高频密码子,再次PCR扩增去信号肽TNF受体(P55)胞外区和IgGFc嵌合基因(TNFR-ED∶IgGFc),亚克隆入pUC19载体,经序列测定正确后克隆入原核表达载体pBV220中.结果成功构建了TNF受体(P55)胞外区和IgGFc嵌合蛋白高效原核表达载体,命名为pBV220/TNFR-ED∶IgGFc.结论 pBV220/TNFR-ED∶IgGFc表达载体的构建,为进一步表达TNF 受体(P55)胞外区和IgGFc嵌合蛋白及其在中和TNF毒副作用、治疗自身免疫性疾病中的作用机制研究奠定了基础.
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TGF-βRⅡ/Fc融合蛋白在杆状病毒系统中的表达
目的: 构建TGF-βRⅡ/Fc融合蛋白的杆状病毒表达系统,并使之成功表达.为将来TGF-βRⅡ/Fc融合蛋白在肺间质纤维化基因治疗中的应用奠定基础.方法: 采用分子克隆技术构建Bac-TRⅡ杆状病毒表达系统;采用DNA脂质体转染技术和昆虫细胞培养技术培养和扩增Bac-TRⅡ重组病毒颗粒;采用免疫荧光技术和免疫印迹法检测目的蛋白的表达.结果: 在重组的Bac-TRⅡ杆状病毒感染的sf9细胞中可以检测到目的蛋白的表达.结论: 重组的Bac-TRⅡ杆状病毒表达系统可以用于正确表达TGF-βRⅡ/Fc融合蛋白.由于杆状病毒表达系统效率较高,因此,今后可利用该系统进行目的蛋白的纯化及进一步的实验研究.
