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CD11b-BFP融合蛋白在U937细胞株中的表达与鉴定
目的:构建并表达巨噬细胞分化抗原1(Mac-1)的α链CD11b与蓝色荧光蛋白(BFP)的融合蛋白CD11b-BFP,为进一步直视研究Mac-1在白细胞内的分布、走向及归宿提供物质条件.方法:首先将CD11b的全长cDNA进行酶切并获得2个片段,将其中含有终止密码的片段作为模板,通过设计引物进行PCR,获得不含有终止密码的该片段,然后与另一片段进行连接,形成不含有终止密码的Mac-1全长cDNA, 将其插入到表达载体pEBFP-N1中,构建完成CD11b-BFP融合基因,后将其转染至U937细胞株中,通过荧光显微镜观察与流式细胞术检测Mac-1的表达及其黏附活性来进行鉴定.结果:经酶切鉴定,pCD11b-BFP构建完全正确,转染U937细胞株后,可见CD11b-BFP融合蛋白发出的蓝色荧光.结论:构建完成CD11b-BFP融合基因并在U937细胞株中进行表达.
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Mac-1在破骨细胞分化中的作用
目的:探究巨噬细胞分化抗原1(Mac-1)分子在核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导的破骨细胞分化中作用的分子机制.方法:取4周龄C57BL/6J小鼠脾细胞,用RANKL及巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导,同时用抗CD11b及抗CD18的特异性抗体进行处理,1周后对细胞核和细胞骨架进行染色;用抗CD11b抗体、干扰CD11b基因的慢病毒及其对照空载病毒处理RANKL诱导的破骨细胞,1周后对细胞进行免疫荧光染色;取4周龄C57BL/6J小鼠脾细胞用RANKL及M-CSF诱导,同时用抗CD11b抗体、干扰CD11b的慢病毒及其对照空载病毒分别进行处理,1周后提取总蛋白进行Western blot检测.结果:CD11b抗体组和双抗体组的多核细胞形成率低于对照组和CD18抗体组,双抗体组和CD11b抗体组之间多核细胞形成率的差异不具有统计学显著性;免疫荧光双标结果显示病毒组的CD11b、Syk及NFATc1表达强度均低于对照病毒组,CD11b抗体组的CD11b、Syk及NFATc1表达强度均低于对照组;Western blot结果显示,CD11b抗体组的CD11b、Syk、NFATc1、c-Fos及p-ERK/ERK水平均低于对照组,病毒组的CD11b、Syk、NFATc1、c-Fos及p-ERK/ERK水平均低于对照病毒组.结论:Mac-1分子中CD11b亚基对破骨细胞分化具有促进作用.该分子通过激活下游Syk通路,上调c-Fos,增加ERK活性,终上调NFATc1而促进破骨细胞的分化.
