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DOC-2作用蛋白的筛选及与TGFβⅢ受体相互作用的初步验证
背景与目的:人卵巢癌差异表达基因DOC-2既是肿瘤抑制基因也是信号分子,参与细胞的生长分化过程.筛选DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域PID (nDOC-2)的相互作用蛋白并进行初步验证,为研究DOC-2的信号通路提供线索.方法:将含有人DOC-2氨基端PID结构域cDNA的片断插入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母菌AH109并在其内表达,然后转化人胎脑cDNA文库,在营养缺陷培养基和X-α-半乳糖苷酶(X-α-gal)上进行阳性克隆的双重筛选,PCR扩增目的片段,测序,并进行生物学分析,寻找DOC-2氨基端PID结构域的相互作用蛋白.将DOC-2 cDNA和TGFβⅢ受体cDNA共转染人卵巢癌细胞系HO-8910,利用免疫沉淀和Western Blot,对TGFβⅢ型受体是否能与DOC-2相互作用进行初步分析.结果:经扩增和筛选胎脑cDNA文库及序列分析,21个侯选阳性克隆中3个克隆为:APLP1、TGFβⅢ型受体的部分mRNA和PCDHGC3 (protocadherin gamma subfamily C3).免疫沉淀及Western blot结果显示,DOC-2与TGFβⅢ型受体相互作用后可形成蛋白复合物.结论:获得的3个基因编码的蛋白可能参与了DOC-2的信号转导,DOC-2与TGFβⅢ型受体可能存在互相作用,并通过TGFβⅢ型受体在TGFβ的信号通路中起作用.
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人DOC-2氨基端PID结构域的克隆与原核表达
目的:克隆人DOC-2氨基端PID结构域(暂命名为nDOC-2),并在原核细胞中表达.方法:用RT-PCR从正常人卵巢组织中扩增nDOC-2基因,并克隆到载体pUC-19中.经测序证实后,用BamH I/EcoR I双酶切,亚克隆到原核表达载体pGEX- 4T-1,并转化E.coli DH5α菌株.取工程菌,用IPTG诱导表达 ,对表达产物进行SDS-PAGE鉴定.结果:①经RT-PCR、测序和酶切鉴定,成功地克隆了人nDOC-2基因.②经IPTG诱导的重组质粒pGEX- 4T-nDOC-2表达出相对分子质量(Mr)约为50 000的融合蛋白,与预期的结果相符.结论:成功克隆到人DOC-2氨基端PID结构域,并在E.coli DH5α中表达出GST-nDOC-2 融合蛋白.
