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高迁移率族B1 A-box文献资料
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HMGB1分子A-Box的表达纯化及其促分化功能鉴定的研究
目的 克隆人HMGB1 A-box的cDNA,构建高效稳定的大肠杆菌(E.coli)表达菌株并对其诱导表达纯化,同时探讨其对间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)的促分化作用.方法 根据优选合成的HMGB1基因序列设计引物,PCR扩增目的基因片段,插入克隆载体pGEM-T并进行序列测定.重组克隆载体经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切,琼脂糖凝胶电泳分离目的基因,插入含His标签的表达载体pET24a.将构建的质粒转染BL21大肠杆菌,经IPTG诱导后,SDS-PAGE观察表达量.HIS-link层析柱纯化重组人HMGB1 A-box,蛋白印迹鉴定重组蛋白.将重组蛋白加入hBMSC培养体系中培养一周后,碱性磷酸酶染色检测其促MSC成骨分化作用.结果 经RT-PCR扩增得到了261 bp的DNA片段,经测序分析,与GenBank中报道的已知序列完全一致,构建了含融合蛋白的重组表达质粒.经诱导后细菌高表达A-box,表达量为总蛋白的45％.经层析柱纯化后,蛋白印迹证实目的蛋白为高纯度的A-box.将A-box加入MSC培养体系中培养后,细胞活性无明显改变,但细胞碱性磷酸酶表达明显增高.结论 成功构建了重组人HMGB1 A-Box的表达载体,纯化的重组蛋白能有效促进MSC向成骨细胞分化.
关键词： 高迁移率族B1 A-box 间充质干细胞 成骨细胞
