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日本血吸虫P7抗原的克隆表达、虫期特异性分析以及早期诊断价值的研究
目的 克隆表达日本血吸虫(Schistosoma japonicum) P7抗原片段(GenBank登录号为EU121231),研究各虫期中该目的 片段的转录和表达情况,初步评价其作为早期诊断抗原的潜力.方法 将日本血吸虫童虫cDNA文库中免疫筛选出的阳性克隆P7进行体外扩增,将目的 基因亚克隆至原核表达载体pET28a中.用双酶切的方法鉴定重组质粒,将阳性重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化.用蛋白质印迹(Western blotting)分析初步鉴定表达产物的免疫诊断价值.利用逆转录PCR和Western blotting分析检测P7片段在日本血吸虫各个虫期中的转录和表达情况.以P7重组蛋白为抗原用间接ELISA检测感染日本血吸虫后14 d的兔血清(18份),日本血吸虫病(28份)、华支睾吸虫病(30份)和卫氏并殖吸虫病(20份)患者血清,以及健康人血清(30份),计算特异性和敏感性.结果 成功构建了重组表达载体P7/pET28a,并在E.coli中表达.Western blotting分析结果显示P7重组蛋白能被感染日本血吸虫后14 d的小鼠血清和P7重组蛋白免疫的多抗兔血清识别,但不能被感染后42 d的小鼠血清识别,蛋白相对分子质量(Mr)约为20 100.采用逆转录PCR技术在尾蚴、童虫和成虫中均检测到了P7片段的mRNA.Western blotting分析结果显示,仅在童虫阶段检测到目的 蛋白.间接ELISA检测感染早期兔血清的检出率为83.3%(15/18),检测日本血吸虫病患者血清的敏感性为75.0%(21/28),特异性为93.8%(75/80),与华支睾吸虫病和卫氏并殖吸虫病患者血清的交叉反应分别为6.7%(2/30)和5.0%(1/20).结论 日本血吸虫P7抗原可能为潜在的日本血吸虫病早期诊断的靶分子.
